雌二醇和孕酮對雙側(cè)卵巢切除小鼠子宮局部巨噬細胞及M-CSF表達的影響研究

姚國榮浙江省湖州市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江湖州313000

雌二醇和孕酮對雙側(cè)卵巢切除小鼠子宮局部巨噬細胞及M-CSF表達的影響研究

姚國榮
浙江省湖州市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江湖州313000

目的分析雌二醇和孕酮對雙側(cè)卵巢切除小鼠子宮內(nèi)膜巨噬細胞及巨噬細胞集落刺激因子表達的影響。方法將雙側(cè)卵巢切除小鼠作為研究對象，分為對照組、雌激素組和孕激素組，對照組小鼠皮下注射芝麻油0.1 mL，雌激素組皮下注射雌二醇（100 ng/只），孕激素組皮下注射孕酮（2 mg/只），分析各組小鼠子宮內(nèi)膜巨噬細胞的數(shù)量和巨噬細胞集落刺激因子的表達強度。結(jié)果雌激素組和孕激素組小鼠子宮內(nèi)膜巨噬細胞數(shù)量明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=17.35，P＜0.05，t雌激素6h=9.21，t雌激素24h=9.32，t孕激素6h=9.56，t孕激素24h=8.94）；雌激素組與孕激素組小鼠子宮內(nèi)膜M-CSF表達6 h、24 h后明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.03，P＜0.05，t雌激素6h=224.14，t雌激素24h=218.15，t孕激素6h=15.72，t孕激素24h=13.44）。結(jié)論雌二醇和孕酮都對子宮內(nèi)膜巨噬細胞有趨化作用，并可以誘導(dǎo)巨噬細胞集落刺激因子的表達。

雌二醇；孕酮；巨噬細胞；巨噬細胞集落刺激因子

子宮是哺乳動物胚胎生長發(fā)育的場所，雌激素可使子宮內(nèi)膜增生增厚，為胚胎著床提供重要條件[1]。孕酮由黃體細胞分泌，為受精卵的發(fā)育提供適宜的環(huán)境[2]。巨噬細胞（macrophage）是子宮內(nèi)一種常駐免疫細胞，對子宮的免疫調(diào)節(jié)起到重要作用[3]。巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，MCSF）是一種多肽造血生長因子，對哺乳動物的生殖功能起著重要作用[4]。已有研究顯示，人和嚙齒類動物子宮內(nèi)巨噬細胞的表達和分布與卵巢甾體性激素——雌孕激素密切相關(guān)[5]，但具體機制未見深入研究。本文對去勢模型小鼠子宮內(nèi)膜巨噬細胞及巨噬細胞集落刺激因子表達受雌二醇和孕酮的影響做了進一步的研究。

1 對象與方法

1.1 實驗對象

性發(fā)育成熟的雌性昆明小鼠（浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供），體重（31±3）g，8~10周齡，自由飲水?dāng)z食。

1.2 時間及地點

實驗于2014年12月～2015年2月在浙江省湖州市中心醫(yī)院完成。

1.3 試劑

所用試劑：雌激素（美國Sigma公司），孕激素（美國Sigma公司），一抗：大鼠抗小鼠F4/80（BM8）抗體（上海優(yōu)寧維生物科技有限公司），二抗：兔抗大鼠IgG（上海優(yōu)寧維生物科技有限公司），芝麻油（美國Sigma公司），1%戊巴比妥鈉（美國Sigma公司），DAB顯色劑（上海滬震實業(yè)有限公司），即用型SABC試劑盒（北京諾博萊德科技有限公司），枸櫞酸鹽緩沖液（pH=6.0）（北京諾博萊德科技有限公司），PBS緩沖液（pH=7.4～7.6）（北京諾博萊德科技有限公司），內(nèi)源性過氧化物酶抑制劑（北京諾博萊德科技有限公司），4%多聚甲醛（阿拉丁試劑（上海）有限公司）。

1.4 設(shè)備

石蠟切片機，石蠟包埋機（德國徠卡公司），生物組織攤烤片機（湖北孝感市諾普電子科技有限責(zé)任公司），恒溫箱（四川瑞朗醫(yī)療器械有限公司），光學(xué)顯微鏡，微量加樣槍（0.5～10 μL、20～200 μL，賽默飛世爾科技中國有限公司），Nikon顯微鏡和照相系統(tǒng)（尼康儀器（上海）有限公司）以及剪刀、鑷子、解剖盤等解剖工具。

1.5 方法

1.5.1 建立去勢小鼠模型雙側(cè)卵巢切除小鼠（去勢小鼠）模型建立方法：每只小鼠腹腔注射0.3 mL 1%戊巴比妥鈉溶液，小鼠完全麻醉后，取一側(cè)身體朝上，脫毛后用75%酒精消毒，并用無菌棉簽擦干。用手術(shù)剪在右側(cè)部皮膚取約1 cm切口，在右側(cè)卵巢脂肪墊上的皮膚做切口，用攝子夾住脂肪墊，將輸卵管和卵巢拉出腹腔。使用鑷子撕開輸卵管和卵巢外面包裹的囊膜，使卵巢暴露。在卵巢與輸卵管之間用縫線結(jié)扎，剪刀剪去卵巢，用鑷子把子宮角送回腹腔，再關(guān)閉腹腔。切除左側(cè)卵巢方法同上。術(shù)后保暖小鼠直至蘇醒，繼續(xù)正常喂養(yǎng)至術(shù)后18 d，此時小鼠體內(nèi)雌孕激素可代謝完全。

1.5.2 建模成功驗證①小鼠子宮形態(tài)學(xué)觀察：將處于動情期、動情間期的正常小鼠5只以及去勢小鼠5只于術(shù)后18 d頸椎脫臼處死，腹部脫毛后酒精消毒，用剪刀和鑷子在腹部剪開約0.5 cm長的刀口，分離皮膚肌層。換一套新的剪刀和鑷子剪開腹膜。找到子宮，另換剪刀和鑷子去除周圍脂肪組織，將子宮整個取出。②血中雌孕激素測定：分別取5只正常小鼠和去勢小鼠，眼眶采血，離心20 min后取上清進行檢測。

1.6 分組及干預(yù)

將48只去勢小鼠分為雌激素組、孕激素組和對照組，每組16只。雌激素組皮下注射雌二醇0.1 mL（100 ng/只），通過頸椎脫臼法6 h后處死8只，24 h后處死剩余8只。孕激素組皮下注射孕酮0.1 mL（2 mg/只），通過頸椎脫臼法6 h后處死8只，24 h后處死剩余8只。對照組皮下注射芝麻油0.1 mL，不進行其他處理。分別取其子宮待檢，方法同1.5.2中①所述。

1.7 免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組織化學(xué)染色法研究不同時間點小鼠子宮內(nèi)膜巨噬細胞的數(shù)量和M-CSF的表達強度：①取材：取子宮標本固定、包埋、切片；②脫蠟：經(jīng)二甲苯、無水乙醇、乙醇脫蠟處理；③沖洗：流動水沖洗10 min；④處理：使用內(nèi)源性抗過氧化物酶抑制劑來處理切片，并再次清洗、甩干；⑤抗原修復(fù)：切片置入枸櫞酸鹽配制成的緩沖液中，反復(fù)加熱1～2次，冷卻后用PBS洗滌；⑥孵育：依次滴加兔血清、大鼠抗小鼠F4/80抗體、兔抗大鼠IgG和SABC試劑，每次操作后在室溫下孵育一段時間；⑦顯色：使用DAB顯色試劑盒，A、B、C試劑與蒸餾水混勻加至切片，室溫下顯色；⑧藍化：蘇木精復(fù)染，在鹽酸乙醇中分色后再用自來水沖洗，等待切片呈藍色；⑨脫水：依次經(jīng)過乙醇、無水乙醇脫水，經(jīng)二甲苯透明處理；⑩封固：用中性樹脂封固，將切片放入烘箱中過夜。

處理后的石蠟標本切片，切片厚度4 μm，每個標本取5張切片，每張切片在顯微鏡下觀察，隨機取3個視野，觀察并記錄陽性巨噬細胞的數(shù)量和M-CSF積分光密度IOD值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 建模驗證結(jié)果

2.1.1 小鼠子宮形態(tài)學(xué)觀察與正常小鼠相比，去勢小鼠18 d后子宮呈線狀，明顯萎縮。見圖1。

2.1.2 血中雌孕激素測定結(jié)果正常小鼠血中雌孕激素濃度分別為（130.35±25.31）pmol/L、（25.34±4.09）nmol/L，去勢小鼠血中雌孕激素濃度分別為（42.13±7.87）pmol/L、（6.37±1.02）nmol/L，正常小組血中雌孕激素含量顯著高于去勢組小鼠，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=15.21、13.29，P均＜0.05）。

圖1 小鼠子宮形態(tài)學(xué)比較

2.2 免疫組化結(jié)果

巨噬細胞和M-CSF陽性部位呈現(xiàn)棕褐色或棕黃色，陽性顆粒分別位于細胞膜質(zhì)和細胞漿中，與背景色對比顯著。

2.2.1 雌二醇、孕酮對小鼠子宮內(nèi)膜巨噬細胞數(shù)量的影響小鼠子宮內(nèi)膜巨噬細胞呈圓形或不規(guī)則形，主要分布在腺體周圍。對照組小鼠子宮內(nèi)膜巨噬細胞很少，集中分布在內(nèi)膜底部和基層交界處，雌激素組與孕激素組小鼠子宮內(nèi)膜巨噬細胞6 h后明顯增加，24 h后與對照組相比仍呈增加趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=17.35，P＜0.05，t雌激素6h=9.21，t雌激素24h=9.32，t孕激素6h=9.56，t孕激素24h=8.94）。見表1、圖2。

表1 三組小鼠子宮內(nèi)膜巨噬細胞數(shù)量對比

表1 三組小鼠子宮內(nèi)膜巨噬細胞數(shù)量對比

注：*與對照組相比，P＜0.05

組別n6 h24 h對照組雌激素組孕激素組16 16 16 1.52±0.13 4.73±1.11*3.40±1.09*1.73±0.15 3.06±0.24*3.41±0.15*

2.2.2 雌二醇、孕酮對小鼠子宮內(nèi)膜M-CSF表達強度的影響對照組小鼠子宮內(nèi)膜M-CSF表達呈弱勢，雌激素組與孕激素組小鼠子宮內(nèi)膜M-CSF表達6 h、24 h后明顯增強，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.03，P＜0.05，t雌激素6h=224.14，t雌激素24h=218.15，t孕激素6h=15.72，t孕激素24h=13.44），見表2、圖3。

表2 三組小鼠子宮內(nèi)膜M-CSF表達量對比

表2 三組小鼠子宮內(nèi)膜M-CSF表達量對比

組別n6 h24 h對照組雌激素組孕激素組16 16 16 76.12±15.37 96325.78±693.61 6079.14±177.52 79.08±19.54 40089.21±9298.24 6910.31±982.35

圖2 三組小鼠子宮內(nèi)膜巨噬細胞鏡檢圖（免疫組化染色，X 400）

3 討論

3.1 雌孕激素對巨噬細胞數(shù)量影響

作為胚胎及胎兒生長和發(fā)育的部位，子宮在哺乳動物繁衍中發(fā)揮重要作用。子宮內(nèi)的主要白細胞亞型包括中性粒細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞[6]。巨噬細胞來源于血液，屬于單核細胞，是子宮內(nèi)常駐免疫細胞的一種，參與子宮免疫調(diào)節(jié)、應(yīng)答和免疫效應(yīng)等環(huán)節(jié)，對機體生殖能力，特別是妊娠建立與維持有重要影響[2]。

雌激素是體內(nèi)非常重要的甾體性激素，在子宮內(nèi)膜受容性的建立以及調(diào)節(jié)過程中起著重要作用[7]，已有研究表明巨噬細胞表面存在著雌激素受體[8]。本研究證實雌激素對巨噬細胞具有趨化作用，初步推測其機制是雌激素與子宮內(nèi)部的雌激素受體特異性結(jié)合，促進巨噬細胞趨化因子表達，從而增加巨噬細胞的數(shù)量。

孕酮是維持妊娠的主要激素，是一種重要的生殖激素[9]。國內(nèi)外已有關(guān)于孕酮對巨噬細胞數(shù)量影響的研究，但是結(jié)果存在爭議，其主要原因是研究對象的條件各異，存在不同干擾因素，如胚胎在妊娠期對巨噬細胞的影響，雌、孕激素水平和比值等；離體條件下的研究無法反映在體條件下激素對巨噬細胞的影響[10-13]。Wood等采用去勢小鼠作為研究對象，發(fā)現(xiàn)外源性補充雌激素時小鼠子宮巨噬細胞數(shù)量增加，若同時給予雌激素和孕激素會使小鼠子宮巨噬細胞進一步增多，說明適量孕激素對雌激素巨噬細胞的趨化作用起到協(xié)同效應(yīng)[14]。但也有學(xué)者使用體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細胞研究發(fā)現(xiàn)，孕激素可分泌巨噬細胞趨化因子，推測孕酮本身對巨噬細胞具有趨化作用[15]。

圖3 三組小鼠子宮內(nèi)膜M-CSF鏡檢圖（免疫組化染色，X 400）

本研究采用去勢小鼠作為研究對象，去勢小鼠造模后子宮中巨噬細胞數(shù)量明顯減少，補充給予孕激素6 h后，與對照組比較，巨噬細胞明顯增加，表明孕激素本身對子宮巨噬細胞具有趨化作用。實驗中造模小鼠全部待術(shù)后18 d進行試驗，消除了體內(nèi)生殖激素的影響，結(jié)果可靠。

3.2 雌孕激素對M-CSF表達的影響

M-CSF是一種由二硫鍵連接的同源雙體糖蛋白，其表達形式有3種：膜結(jié)合型、細胞外基質(zhì)結(jié)合型和可溶型[16]。人和嚙齒類動物的大部分器官都能夠表達M-CSF，不過表達量較少，只有在子宮中出現(xiàn)高度表達，胎盤及子宮內(nèi)膜組織中都可見M-CSF表達[17]。成熟M-CSF分子在靠近N端的150氨基酸在和MCSF受體結(jié)合過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，人與小鼠的M-CSF分子在這個區(qū)域的結(jié)構(gòu)高度保守，同源性高達80%；人的M-CSF可作用于小鼠，但是小鼠的M-CSF具有其種屬特異性[18]。機體的多種細胞可以產(chǎn)生M-CSF，如纖維細胞、骨髓基質(zhì)細胞、腦星狀細胞、激活的巨噬細胞、T細胞、B細胞與內(nèi)皮細胞等[19]；另外淋巴母細胞性白血病、乳腺癌、卵巢癌和肺腺癌等多種腫瘤細胞也可以產(chǎn)生M-CSF[20]。

本研究以去勢小鼠為模型，研究單一雌激素及孕激素對M-CSF表達的影響。結(jié)果顯示，外源性補充雌激素6 h及24 h后，子宮M-CSF表達顯著升高。補充孕激素后24 h子宮M-CSF表達顯著升高。證實單一雌激素或孕激素可促使子宮M-CSF的表達。

綜上所述，單一劑量雌、孕激素可以促進巨噬細胞數(shù)量增加，誘導(dǎo)M-CSF的表達，并且巨噬細胞數(shù)量和M-CSF表達的變化一致。

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Effects of estradiol and progesterone on local macrophage and M-CSF expression in mouse uterus of resection of both ovaries

YAO Guorong
Department of Obstetrics and Gynecology，Huzhou City Central Hospital，Zhejiang，Huzhou313000，China

ObjectiveTo analyze the effects of estradiol and progesterone on endometrium macrophages and M-CSF（macrophage colony-stimulating factor）expression in mice with bilateral oophorectom.MethodsMice with bilateral oophorectom were selected as the research objects and divided into estrogen group，progesterone group and control group respectively.Mice of control group was subcutaneously injected 0.1 mL sesame oil，mice of estrogen group was subcutaneously injected estradiol 100 ng per one，mice of progesterone group was subcutaneously injected orogesterone 2 mg per one.The number of endometrial macrophages and the expression level of M-CSF were analyzed.Results The number of endometrial macrophages in estrogen group and in progesterone group were both more than the control group’s，the difference was statistically significant（F=17.35，P＜0.05，testrogen6h=9.21，testrogen24h=9.32，tprogesterone6h=9.56，tproges-terone24h=8.94）.Also，the expression level of M-CSF in estrogen group and progesterone group were higher than that in the control group，the difference was statistically significant（F=9.03，P＜0.05，testrogen6h=224.14，testrogen24h=218.15，tprogesterone6h=15.72，tprogesterone24h=13.44）.Conclusion Both estradiol and progesterone can increase the number of endometrial macrophage and induce the expression of M-CSF.

Estradiol；Progesterone；Macrophages；M-CSF

R96

A

1673-9701（2015）18-0022-04

2015-04-13）