重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療大鼠糖尿病周圍神經(jīng)病變的效果

白 羊 章永壘 黃奮飛 陳勝亮 阮 卡 陳 星▲

未名生物醫(yī)藥有限公司，福建廈門361009

重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療大鼠糖尿病周圍神經(jīng)病變的效果

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目的觀察重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子（rhNGF）治療大鼠糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）效果。方法選用健康成年的雄性SD大鼠，腹腔注射鏈脲霉素（STZ）建立糖尿病（DM）大鼠模型。1個(gè)月后檢測(cè)大鼠尾部感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度（SNCV），以SNCV＜30m/s為DPN成模標(biāo)準(zhǔn)。將DPN大鼠隨機(jī)分為6組，分別為模型對(duì)照組、受試藥rhNGFⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ（劑量分別為0.3、1、3、9μg/kg）4個(gè)劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組（依帕司他15mg/kg），同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組。連續(xù)給藥2個(gè)月，檢測(cè)大鼠體重、血糖、大鼠尾部SNCV、坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度（MNCV）以及坐骨神經(jīng)中果糖及山梨醇含量。結(jié)果DM造模1個(gè)月后，模型對(duì)照組大鼠體重、血糖值、尾部SNCV和坐骨神經(jīng)MNCV均與正常對(duì)照組有明顯差異（P＜0.01），表明DPN造模成功。受試藥rhNGF對(duì)DPN大鼠體重和血糖值無(wú)顯著影響（P＞0.05），對(duì)大鼠尾部SNCV和坐骨神經(jīng)MNCV具有明顯改善作用，給藥2個(gè)月rhNGF受試組（Ⅲ）大鼠尾部SNCV、rhNGF受試組（Ⅱ、Ⅲ）坐骨神經(jīng)MNCV較模型對(duì)照組高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。DPN大鼠坐骨神經(jīng)中果糖及山梨醇的含量顯著升高，說(shuō)明DPN的發(fā)生與多元醇代謝紊亂具有相關(guān)性。受試藥rhNGF能降低DPN大鼠坐骨神經(jīng)中果糖及山梨醇的含量，其中果糖含量變化具有一定的劑量相關(guān)性，而山梨醇含量變化未發(fā)現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)。結(jié)論受試藥rhNGF對(duì)DPN大鼠神經(jīng)具有較好的保護(hù)作用，與陽(yáng)性對(duì)照藥依帕司他作用相似，可能與改善DPN大鼠的多元醇代謝相關(guān)。

糖尿??；糖尿病周圍神經(jīng)病變；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；神經(jīng)傳導(dǎo)速度；山梨醇；果糖

糖尿?。╠iabetesmellitus，DM）是常見的代謝性疾病，據(jù)估計(jì)我國(guó)約有11.6%的成人患有DM［1］。糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是DM最常見的慢性并發(fā)癥之一［2］。應(yīng)用外源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）有助于DPN癥狀減輕［3］，臨床上可有效地改善DPN的神經(jīng)癥狀、血清蛋白含量和血液流變學(xué)［4-8］。但目前國(guó)內(nèi)使用的NGF主要來(lái)源為天然提純，與天然NGF相比，重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子（recombinanthumannervegrowth factor，rhNGF）具有易獲得、高產(chǎn)率、高活性與低成本等特點(diǎn)［9］。本文對(duì)DPN大鼠給予rhNGF治療，對(duì)治療前后體重、血糖值、大鼠尾部感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度（sensory nerve con duction velocity，SNCV）和坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（motor nerve conduction velocity，MNCV）以及大鼠坐骨神經(jīng)中果糖、山梨醇含量進(jìn)行了比較，對(duì)rhNGF對(duì)大鼠DPN的治療效果進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

體重200～250 g的健康雄性SPF級(jí)SD大鼠，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：44002100003545）。rhNGF（未名生物醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：BW 101），采用E.coli重組表達(dá)［10］，HPLC檢測(cè)純度＞98.0%，TF-1細(xì)胞法檢測(cè)體外生物學(xué)活性＞500 AU/μg。

1.2 儀器與試劑

T1000Y電子天平（美國(guó)雙杰兄弟公司）、BS211D型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）、BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）、羅氏卓越血糖儀（羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）、GC2010 plus氣相色譜儀（島津企業(yè)管理有限公司）、DMT-2500多管渦混合儀（杭州米歐儀器有限公司）、TGL20MW離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）、NDK200-2氮吹儀（杭州米歐儀器有限公司）、懸轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）、T18D10G勻漿機(jī)（德國(guó)IKA有限公司）。

鏈脲霉素，Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：WXBB2432V；水合氯醛，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130325；甲醇，色譜純，Honeywell，批號(hào)：NAAG3H；三氟乙酸，分析純，上海晶純生化科技股份有限公司，批號(hào)：E1421021；吡啶，色譜純，上海晶純生化科技股份有限公司，批號(hào)：J1329001；N，N-二甲基乙酰胺，色譜純，上海晶純生化科技股份有限公司，批號(hào)：C1425015；乙酸酐，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20141211；山梨醇對(duì)照品，Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：MKBM0921V；果糖對(duì)照品，中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)：100231-201305。

表1 給藥方案

1.3 方法

1.3.1 造模方法

選用健康成年的SD大鼠158只，體重200～250 g，腹腔注射鏈脲霉素（STZ 60 mg/kg），1周后測(cè)定血糖，以血糖≥16.7mmol/L作為DM成模標(biāo)準(zhǔn)，DM模型成功后大鼠出現(xiàn)多飲多食、多尿、體重增長(zhǎng)緩慢或體重減輕的癥狀。待DM模型建立1個(gè)月后，檢測(cè)大鼠尾部SNCV，以＜30 m/s為DPN大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 分組及給藥方案

1.3.2.1 動(dòng)物分組選取DPN造模成功的90只大鼠隨機(jī)分為6組（n=15），分別為模型對(duì)照組、受試藥Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ（rhNGF劑量分別為0.3、1、3、9μg/kg）4個(gè)劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組，同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組。

1.3.2.2 給藥途徑①受試藥組：按上述劑量肌內(nèi)注射給藥，給藥體積1mL；②正常對(duì)照組、模型對(duì)照組：給予受試藥組等體積的0.9%氯化鈉注射液，肌內(nèi)注射給藥；③陽(yáng)性藥對(duì)照組：依帕司他（15 mg/kg），灌胃給藥，給藥體積10 mL。給藥頻率及周期：每天1次，連續(xù)給藥2個(gè)月，具體見給藥方案見表1。

1.3.3 體重及血糖檢測(cè)

每周檢測(cè)大鼠體重；給藥后每月測(cè)試動(dòng)物血糖。

1.3.4 大鼠尾部SNCV檢測(cè)

給藥后每月檢測(cè)1次大鼠尾部SNCV。大鼠用10%水合氯醛麻醉后俯臥位固定，清潔大鼠尾部皮膚，電極放置方式為一對(duì)刺激電極（負(fù)極位于正極近心側(cè)）插入大鼠尾部皮下，然后依次插入記錄電極Ⅰ和記錄電極Ⅱ，記錄電極Ⅰ在刺激電極負(fù)極近心側(cè)2 cm處，記錄電極Ⅱ在記錄電極I近心側(cè)2 cm處，再將參考電極Ⅰ、Ⅱ分別插入距記錄電極Ⅰ、Ⅱ近心側(cè)0.5 cm處皮下，最后將接地電極插入刺激電極負(fù)極與記錄電極Ⅰ之間。采用BL420F型多道生理信號(hào)處理系統(tǒng)測(cè)定各組大鼠尾部SNCV，重復(fù)刺激3次，間隔30 s，取平均值。尾部SNCV（m/s）=記錄兩電極之間的距離/動(dòng)作電位潛伏期時(shí)間差［6］。

1.3.5 坐骨神經(jīng)MNCV檢測(cè)

末次給藥檢測(cè)SNCV后，檢測(cè)MNCV（m/s）。將大鼠俯臥位固定，分離右側(cè)坐骨神經(jīng)約20 mm，用兩對(duì)并列固定的勾式刺激電極（雙極保護(hù)電極）置于坐骨神經(jīng)上，分為中樞端和外周端，兩對(duì)電極之間的距離為15 mm，于腓腸肌處用一對(duì)針式電極插到腓腸肌上記錄誘發(fā)的復(fù)合動(dòng)作電位（兩電極之間距離約為8mm）。用單脈沖方波刺激，波寬0.1ms，自動(dòng)增量刺激誘發(fā)產(chǎn)生復(fù)合動(dòng)作電位。計(jì)算兩對(duì)刺激電極之間的距離（D），測(cè)量?jī)牲c(diǎn)傳導(dǎo)所需要的時(shí)間（T2-T1）。MNCV=D/（T2-T1）［11］。

1.3.6 坐骨神經(jīng)果糖及山梨醇的含量

取大鼠左側(cè)坐骨神經(jīng)，用純水沖洗，稱重，按照1根坐骨神經(jīng)加1mL純水后勻漿，4℃下2000 r/min離心10 min，取得即勻漿上清液。取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μL（果糖3 mg/m L、山梨醇2 mg/mL），在80℃金屬浴中氮?dú)獯蹈?，加?00μL勻漿上清液復(fù)溶后，加入100μL 10%三氟乙酸溶液，在12 000 r/min下離心10 min，取上清液300μL，在80℃水浴中減壓蒸干，依次加入0.5mL吡啶、0.5mLN，N-二甲基乙酰胺，1mL乙酸酐，混勻后在90℃水浴中反應(yīng)40min，過(guò)0.45μm濾膜后注入氣相色譜儀檢測(cè)。氣相色譜條件：毛細(xì)管柱：Rtx-5（0.25 mm×30 mm；膜厚0.25μm）；載氣：氮?dú)?；流速?.4 mL/min；程序升溫150℃（保留2 min），5℃/min升溫至250℃，再以10℃/min升溫至290℃（保留9min）；氣化室溫度：280℃；檢測(cè)器：氫火焰檢測(cè)器；進(jìn)樣量1μL［12］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重、血糖水平比較

DM造模大鼠體重均低于正常對(duì)照組且差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），血糖值均大于16mmol/L，高于正常對(duì)照組且差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明DM造模成功。連續(xù)給藥2個(gè)月DPN大鼠體重、血糖均保持穩(wěn)定，與模型對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠給藥前后血糖水平比較（mmol/L，x±s）

2.2 大鼠尾部SNCV、坐骨神經(jīng)MNCV

DM大鼠造模1個(gè)月后，模型對(duì)照組及各給藥組大鼠尾部SNCV（均＜30 m/s）低于正常對(duì)照組且差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明DPN造模成功。給藥過(guò)程中，模型對(duì)照組大鼠尾部SNCV隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐步降低，提示在沒有藥物干預(yù)情況下，大鼠DPN癥狀加重。rhNGF各受試組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠尾部SNCV和坐骨神經(jīng)MNCV均較模型對(duì)照組高，其中給藥1個(gè)月rhNGF受試組（Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）與陽(yáng)性對(duì)照組大鼠尾部SNCV較模型對(duì)照組高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；給藥2個(gè)月rhNGF受試組（Ⅲ）與陽(yáng)性對(duì)照組大鼠尾部SNCV較模型對(duì)照組高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；給藥2個(gè)月rhNGF受試組（Ⅱ、Ⅲ）與陽(yáng)性對(duì)照組坐骨神經(jīng)MNCV較模型對(duì)照組高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其他各組均有提高但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說(shuō)明rhNGF與陽(yáng)性藥物均對(duì)DPN大鼠尾部SNCV、坐骨神經(jīng)MNCV均有較好的改善作用。見表3。

表3 各組大鼠給藥前后SNCV、坐骨神經(jīng)MNCV比較（m/s，±s）

表3 各組大鼠給藥前后SNCV、坐骨神經(jīng)MNCV比較（m/s，±s）

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；SNCV：感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度；MNCV：運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度

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2.3 大鼠坐骨神經(jīng)中果糖及山梨醇含量

給藥對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)中果糖及山梨醇含量的影響模型對(duì)照組大鼠坐骨神經(jīng)中果糖、山梨醇的含量均高于正常對(duì)照組且差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。給藥2個(gè)月后，rhNGF受試組（Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）和陽(yáng)性對(duì)照組果糖含量低于模型對(duì)照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；rhNGF受試組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）和陽(yáng)性對(duì)照組山梨醇含量低于模型對(duì)照組且差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠給藥后坐骨神經(jīng)中果糖及山梨醇含量比較（μg/mg，±s）

表4 各組大鼠給藥后坐骨神經(jīng)中果糖及山梨醇含量比較（μg/mg，±s）

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

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3 討論

DPN是DM主要的慢性并發(fā)癥之一，其發(fā)病率與DM病程有關(guān)，有60%～90%的患者通過(guò)神經(jīng)功能檢查，均有不同程度的神經(jīng)病變［2,13］。DPN發(fā)病率高，受累神經(jīng)廣泛，臨床癥狀尤其是疼痛持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，嚴(yán)重影響DM患者的生活質(zhì)量，甚至造成嚴(yán)重生活障礙，是醫(yī)學(xué)上急需解決的問(wèn)題［14］。

DPN的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為該病發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果。其中多元醇-肌醇途徑學(xué)說(shuō)認(rèn)為多元醇代謝通路的增強(qiáng)，果糖、山梨醇在神經(jīng)組織細(xì)胞內(nèi)大量蓄積是DPN的重要發(fā)病機(jī)制之一［16-17］。研究表明，DPN時(shí)神經(jīng)組織內(nèi)果糖及山梨醇含量升高，主要與神經(jīng)細(xì)胞外葡萄糖濃度增高有關(guān)［18］，使用醛糖還原酶抑制劑（ARI）如依帕司他能阻止山梨醇的沉積，也能阻止神經(jīng)組織內(nèi)肌醇的減少，從而改善神經(jīng)傳導(dǎo)速度［19-22］。因此，本研究選擇依帕司他作為陽(yáng)性對(duì)照藥，并選擇DM大鼠造模成功1個(gè)月后大鼠尾部SNCV＜30m/s的DPN造模成功的大鼠進(jìn)行試驗(yàn)。

本研究結(jié)果表明，模型對(duì)照組大鼠體重、血糖值、尾部SNCV和坐骨神經(jīng)MNCV均與正常對(duì)照組有明顯差異（P＜0.01），表明DPN造模成功。受試藥rhNGF對(duì)DPN大鼠的體重和血糖值無(wú)明顯影響，對(duì)DPN大鼠尾部SNCV和坐骨神經(jīng)MNCV等周圍神經(jīng)癥狀具有明顯的改善作用（劑量3μg/kg療效最佳）。DPN大鼠坐骨神經(jīng)中果糖及山梨醇的含量顯著升高，說(shuō)明DPN的發(fā)生與多元醇代謝紊亂具有相關(guān)性。受試藥rhNGF能降低DPN大鼠坐骨神經(jīng)中果糖及山梨醇的含量，其中果糖含量變化具有一定的劑量相關(guān)性，而山梨醇含量變化未發(fā)現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)。受試藥rhNGF與陽(yáng)性對(duì)照藥依帕司他對(duì)大鼠DPN的作用機(jī)制類似，與改善DPN大鼠的多元醇代謝相關(guān)。

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Therapeutic effect of recombinant human nerve grow th factor on rats w ith diabetic peripheral neuropathy

BAIYang ZHANG Yonglei HUANG Fenfei CHEN Shengliang RUAN Ka CHEN Xing▲
SinoBioway Biomedicine Co.,Ltd.,Fujian Province,Xiamen 361009,China

Ob jective To observe the therapeutic effect of recombinant human nerve growth factor(rhNGF)on diabetic peripheral neuropathy(DPN)rats.Methods Healthy adultmale SD rats were induced to diabetes rats by intramuscular injection of streptozotocin.After amonth,rats with the tail sensory nerve conduction velocity(SNCV)＜30 m/s were confirmed as DPN model rats.DPN ratswere random ly divided into six groups,including themodel control group,the investigational drug rhNGFⅠ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ(doses of 0.3,1,3,9μg/kg)4 dose groups and the positive control group (epalrestat 15mg/kg),concomitantly with the normal control group.During the administration of 2 months,body weight of ratswere detected weekly,blood glucose and SNCV monthly,sciatic nerve conduction velocity(MNCV)was detected after the last administration,and levels of sorbitol and fructose in sciatic nerve were last measured.Resu lts Body weight,blood glucose,SNCV and MNCV of themodel control group were significantly different with the normal control group after amonth(P＜0.01),showed that the successfulmodeling of DPN.The investigated drug rhNGF and the positive drug epalrestat had no significant effect on body weight and blood glucose of DPN rats(P＞0.05),but improved SNCV and MNCV.At 2 month,SNCV in rhNGF group(Ⅲ)and MNCV in rhNGF group(Ⅱ,Ⅲ)were significantly higher than themodel control group(P＜0.05).Levels of fructose and sorbitol in sciatic nerve raised in DPN rats,indicated the relationship between DPN and polyolmetabolism.rhNGF reduced fructose and sorbitol in sciatic nerve,with dose effect in fructose but not in sorbitol.Conclusion rhNGF has a significant protective effect on nerve of DPN rats, whichmay be associated with improvement of polyolmetabolism similar with epalrestat.

Diabetes mellitus;Diabetic peripheral neuropathy;Recombinant human nerve growth factor; Nerve conduction velocity;Sorbitol;Fructose

R745

A[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]1673-7210（2015）06（c）-0004-05

2015-03-23本文編輯：任念）

國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2011ZX09 401-017）。

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