低溫硝基苯降解菌的降解動(dòng)力學(xué)研究

孫大鵬

(遼寧省環(huán)境監(jiān)控中心，遼寧沈陽(yáng) 110161)

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低溫硝基苯降解菌的降解動(dòng)力學(xué)研究

孫大鵬

(遼寧省環(huán)境監(jiān)控中心，遼寧沈陽(yáng) 110161)

[目的]研究一株低溫硝基苯降解菌的降解動(dòng)力學(xué)。[方法]對(duì)一株耐低溫硝基苯降解菌進(jìn)行研究，考察了其最適生長(zhǎng)條件及在不同硝基苯初始濃度下的生長(zhǎng)和降解情況，并進(jìn)行降解動(dòng)力學(xué)研究。[結(jié)果]當(dāng)溫度為15 ℃，pH為7，搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min，接種量為10%時(shí)，最適宜該菌株生長(zhǎng)。該菌株培養(yǎng)48 h對(duì)200 mg/L硝基苯的好氧降解率達(dá)60.53%。當(dāng)硝基苯初始濃度>100 mg/L時(shí)，該菌株的降解動(dòng)力學(xué)符合Andrews抑制方程-非競(jìng)爭(zhēng)性底物抑制模型。[結(jié)論]該研究可為硝基苯實(shí)際廢水生化處理提供理論依據(jù)。

硝基苯；鮑曼不動(dòng)桿菌；生物降解；動(dòng)力學(xué)

硝基苯是一種帶有苦杏仁味的、淡黃色油狀液體，且不僅微溶于水，還易溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。硝基苯是一種重要的化工合成原料，大量用于合成苯胺、炸藥、染料、塑料等，且在某些工業(yè)領(lǐng)域中，如醫(yī)藥和農(nóng)藥等都具有重要的用途。尤為重要的是，硝基苯可以廢氣廢水為載體，或者以儲(chǔ)存運(yùn)輸、生產(chǎn)過(guò)程中的意外事故為途徑大量進(jìn)入環(huán)境。硝基苯進(jìn)入水體會(huì)長(zhǎng)時(shí)間保持不變[1-2]，對(duì)水體的污染持續(xù)時(shí)間相當(dāng)長(zhǎng)，并且硝基苯是高毒物質(zhì)，具有“三致”效應(yīng)，嚴(yán)重危害人體健康[3-4]，已被列入世界《環(huán)境優(yōu)先控制有毒有機(jī)污染物》的名單前列[5-6]。

由于生物方法日趨成熟且成本較低，近年來(lái)較多使用[7-9]。該試驗(yàn)將低溫保存的一株硝基苯降解菌進(jìn)行馴化培養(yǎng)[10]，并對(duì)其影響硝基苯降解率的環(huán)境因素及不同初始濃度下的硝基苯降解進(jìn)行研究，分析了降解動(dòng)力學(xué)特征[11-12]，為硝基苯實(shí)際廢水生化處理提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種來(lái)源以東北制藥總廠曝氣池和集水池污泥為菌源，分離、篩選得到了一株在低溫條件下能以硝基苯為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株，經(jīng)鑒定為鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)[10，13-14]。

1.2 培養(yǎng)基與試劑平板培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂20 g、蒸餾水1 L、pH 7.0。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：Na2HPO4·12H2O 3.8 g/L、KH2PO41 g/L、NaCl 1 g/L、NH4Cl 0.1 g/L、MgSO40.2 g/L、蒸餾水1 L、pH 7.0。培養(yǎng)基中均添加一定量的硝基苯，121 ℃滅菌30 min。

1.3 試驗(yàn)儀器恒溫振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-QX，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)有限公司)；滅菌箱(MLS-3750，日本三洋電機(jī)公司)；生化培養(yǎng)箱(LRH-250A，廣東省醫(yī)療器械研究所)；電子天平(BS110S，德國(guó)賽多利斯)；紫外分光光度計(jì)(Cary 50，美國(guó)Varian)；離心機(jī)(ANKE TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠)；冰箱(BCD-247，德國(guó)西門(mén)子)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1菌株的馴化。 將低溫保存的鮑曼不動(dòng)桿菌轉(zhuǎn)移到平板培養(yǎng)基上15 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，硝基苯濃度為30 mg/L，首次培養(yǎng)可能需要較長(zhǎng)時(shí)間，大概3～4 d可以看到明顯菌落。然后將此菌落在同濃度硝基苯的條件下再次轉(zhuǎn)移，培養(yǎng)48 h后接種到50 mg/L硝基苯的平板上，之后逐漸增大硝基苯濃度。 無(wú)菌條件下將最后一次平板培養(yǎng)基的菌種置于硝基苯為50 mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中恒溫振蕩培養(yǎng)，每48 h進(jìn)行轉(zhuǎn)移，并逐步提高硝基苯濃度。

1.4.2菌株最適生長(zhǎng)條件的確定。

1.4.2.1最適溫度。配制無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基100 ml于250 ml的錐形瓶中，硝基苯的濃度為200 mg/L(接入菌液后的體積和濃度)，以10%(體積分?jǐn)?shù))接菌量接入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液，分別在10、15、20、25、30、35 ℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，pH為7，搖床轉(zhuǎn)速140 r/min，48 h后取樣測(cè)定菌株的生長(zhǎng)和硝基苯降解情況。

1.4.2.2最適pH。在250 ml錐形瓶中配制體積為100 ml的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，硝基苯濃度為200 mg/L(接入菌液后的體積和濃度)，以10%(體積分?jǐn)?shù))接菌量接入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液，15 ℃，搖床轉(zhuǎn)速140 r/min，pH分別為4、5、6、7、8、9恒溫振蕩培養(yǎng)，48 h后取樣測(cè)定菌株的生長(zhǎng)和硝基苯降解情況。

1.4.2.3最適搖床轉(zhuǎn)速。配制無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基100 ml于250 ml的錐形瓶中，硝基苯的濃度為200 mg/L(接入菌液后的體積和濃度)，以10%(體積分?jǐn)?shù))接菌量接入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液，15 ℃，pH為7，并以50、100、140、160和200 r/min的搖床轉(zhuǎn)速為條件進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，48 h后取樣測(cè)定菌株的生長(zhǎng)和硝基苯降解情況。

1.4.2.4最佳接菌量。配制無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基100 ml于250 ml的錐形瓶中，硝基苯的濃度為200 mg/L(接入菌液后的體積和濃度)，分別按1%、5%、10%、15%、20%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液，15 ℃，pH為7，搖床轉(zhuǎn)速140 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，48 h后取樣測(cè)定菌株的生長(zhǎng)和硝基苯降解情況。

1.4.3硝基苯濃度對(duì)菌株的生長(zhǎng)及降解的影響。分別配制100 ml無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基于250 ml已滅菌的錐形瓶中，使硝基苯濃度分別為50、100、150、200和400 mg/L，加入體積分?jǐn)?shù)為10%的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液，在pH為7，溫度為15 ℃，搖床轉(zhuǎn)速是140 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行振蕩降解，每12 h進(jìn)行取樣，繪制生長(zhǎng)曲線并測(cè)定硝基苯濃度。

1.4.4降解動(dòng)力學(xué)初步分析。將不同濃度的硝基苯加入以硝基苯為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于最佳降解條件下每隔一定時(shí)間取樣，測(cè)定在降解過(guò)程中硝基苯的濃度變化。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)而求出相應(yīng)硝基苯比降解速率，同時(shí)對(duì)所求的數(shù)據(jù)及初始濃度進(jìn)行擬合，最終求出模型參數(shù)。

1.5 分析方法細(xì)胞濃度以新鮮去離子水作參比，采用光電比濁法測(cè)定溶液OD600。硝基苯濃度則采用氣相色譜法測(cè)定。對(duì)樣品進(jìn)行離心后，取其上清液并用正己烷對(duì)上清液進(jìn)行萃取，過(guò)無(wú)水硫酸鈉柱后進(jìn)樣。氣相色譜條件：檢測(cè)器類型為EDC檢測(cè)器；進(jìn)樣口溫度為210 ℃；柱溫為100 ℃，其保持1 min，然后以12 ℃/min升溫至210 ℃；檢測(cè)器溫度為300 ℃；進(jìn)樣量為1 μl。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株生長(zhǎng)的最適條件

2.1.1溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。由圖1可見(jiàn)，菌株在10～35 ℃條件下均可生長(zhǎng)且對(duì)硝基苯有不同程度的降解。在15 ℃時(shí)，菌體的生物量以及對(duì)硝基苯的降解率均達(dá)到最大，為最適溫度，溫度過(guò)高會(huì)破壞細(xì)胞機(jī)體，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，影響菌體對(duì)硝基苯的降解。因此，15～25 ℃為最適菌株生長(zhǎng)的溫度范圍。

2.1.2pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。由圖2可知，菌株在中性到偏弱堿性條件下對(duì)硝基苯的降解能力較強(qiáng)。當(dāng)pH在6～9之間時(shí)，菌株能夠保持其較好的生長(zhǎng)能力以及硝基苯降解能力，特別是在pH為7時(shí)達(dá)到最大值，為菌株最適pH。由此可知，該菌株屬于中性微生物。

2.1.3搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。對(duì)于好氧菌，轉(zhuǎn)速較高的情況下可以提高氧的轉(zhuǎn)移速率，從而使得菌株的生長(zhǎng)得到促進(jìn)，硝基苯的降解率得以提高，而在較低轉(zhuǎn)速的情況下，培養(yǎng)液中的溶氧量較少導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)量的下降。如圖3所示，當(dāng)轉(zhuǎn)速<140 r/min時(shí)，菌株的生長(zhǎng)及其降解能力都受抑制，而隨著轉(zhuǎn)速的增加，菌株的生長(zhǎng)和降解能力有所提升。轉(zhuǎn)速>140 r/min時(shí)，菌株硝基苯降解速度和生長(zhǎng)量增幅比較小，說(shuō)明140 r/min已可以滿足菌株生長(zhǎng)和降解的要求。因此，最適的搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min。

2.1.4接種量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。由圖4可知，菌株的生物量隨著接種量的增加而逐漸增大，菌株對(duì)硝基苯的降解能力也漸漸得到提高，但是當(dāng)菌株接種量>10%的時(shí)候，菌株的生長(zhǎng)情況和降解能力并沒(méi)有隨著接種量的增加而顯著增長(zhǎng)。這是因?yàn)榻臃N量過(guò)大使菌株處于貧營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，生長(zhǎng)代謝能力受到抑制，從而降低硝基苯的降解速率。因此，最適接種量為10%。

2.2 不同硝基苯初始濃度下菌株的生長(zhǎng)及硝基苯降解情況

2.2.1不同硝基苯初始濃度下菌株的生長(zhǎng)情況。圖5為在以硝基苯為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，硝基苯的初始濃度分別為50、100、150、200、400 mg/L，在上述最適生長(zhǎng)條件下菌株的生長(zhǎng)情況。由于硝基苯的毒性較大，對(duì)菌體的生長(zhǎng)有很大的抑制作用，即便是經(jīng)過(guò)馴化的降解菌也需要一定的適應(yīng)期，因此前12 h為菌株的生長(zhǎng)停滯期。12～48 h為菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌株代謝機(jī)能活躍，個(gè)數(shù)呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，此時(shí)大量硝基苯被降解。48～72 h為菌株生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，此期間菌株的生長(zhǎng)和死亡達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，個(gè)數(shù)基本維持不變。進(jìn)入衰亡期是在72 h后，硝基苯的不足導(dǎo)致大多數(shù)的細(xì)胞出現(xiàn)了自溶現(xiàn)象并死亡， 菌株個(gè)數(shù)開(kāi)始減少。如圖5所示，當(dāng)硝基苯濃度為400 mg/L時(shí)，對(duì)菌體產(chǎn)生了非常明顯的毒性，菌體活性基本被抑制，菌株不生長(zhǎng)。因此，該試驗(yàn)菌體對(duì)硝基苯的耐受濃度為400 mg/L。

2.2.2不同初始濃度下菌株降解硝基苯的情況。從圖6所展現(xiàn)的菌株對(duì)硝基苯的降解情況可知，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min，溫度為15 ℃，pH為7時(shí)，當(dāng)50 mg/L作為硝基苯初始濃度時(shí)，硝基苯可于72 h時(shí)被完全降解；初始濃度為100和200 mg/L時(shí)，菌株經(jīng)48 h降解率分別達(dá)到了77.13%和60.53%。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期是降解的主要發(fā)生期，主要是由于這個(gè)期間菌株具有較強(qiáng)的繁殖能力，隨之增大的還有其對(duì)碳源的需求，降解過(guò)程迅速，這就導(dǎo)致了硝基苯濃度下降較快。而在此之后，培養(yǎng)基中的硝基苯已經(jīng)減少又沒(méi)有新的碳源來(lái)進(jìn)行補(bǔ)充，代謝產(chǎn)物也接連不斷地積累，菌體的數(shù)量基本上呈現(xiàn)不增加的狀態(tài)，降解緩慢。

2.3 硝基苯的生物降解動(dòng)力學(xué)如圖7所示，當(dāng)硝基苯初始濃度低于100 mg/L時(shí)，菌株對(duì)硝基苯的降解符合零級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，即c=-kt+b(c為硝基苯的濃度，k為降解速率，t為降解時(shí)間，b為常數(shù))。反應(yīng)速率與硝基苯濃度呈正比例關(guān)系，降解率隨著硝基苯濃度的增加而增加，說(shuō)明在100 mg/L范圍內(nèi)硝基苯的濃度越高，微生物利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也越充分，因此能夠更好地進(jìn)行生長(zhǎng)和大量繁殖，從而提高了降解速率。

由于硝基苯對(duì)微生物具有毒性，當(dāng)硝基苯的初始濃度增加至一定程度時(shí)，反應(yīng)速率不再隨著初始濃度的增加而升高，降解率下降，因?yàn)楦邼舛葪l件下對(duì)微生物產(chǎn)生了抑制現(xiàn)象。當(dāng)硝基苯初始濃度>100 mg/L時(shí)，采用簡(jiǎn)單且常用的Andrews抑制方程-非競(jìng)爭(zhēng)性底物抑制模型(式1)對(duì)菌株降解硝基苯進(jìn)行動(dòng)力學(xué)描述。

(1)

式中，μmax為硝基苯的最大比降解速率(h-1)，S為硝基苯濃度(mg/L)，KS和Ki分別為底物飽和常數(shù)和底物抑制常數(shù)(mg/L)。根據(jù)所取得的試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)非線性最小二乘法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得出的動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)分別為μmax= 2.059 h-1，KS=54.682 mg/L，Ki=64.138 mg/L。對(duì)式(1)求導(dǎo)，得出S=(KSKi)1/2=59.22 mg/L，μ取最大值為0.72 h-1, 這一結(jié)果為硝基苯廢水的生物處理工藝提供了重要的參考條件。

3 結(jié)論

(1)將在低溫條件保存下的一株能以硝基苯為唯一碳源生長(zhǎng)的鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行復(fù)壯，其最適生長(zhǎng)條件為溫度15 ℃，pH為7，搖床轉(zhuǎn)速140 r/min，接種量10%。

(2)在以硝基苯為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，鮑曼不動(dòng)桿菌12 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，48 h趨于穩(wěn)定生長(zhǎng)，72 h后開(kāi)始衰亡。當(dāng)硝基苯初始濃度為50 mg/L，72 h可被完全降解，菌株48 h對(duì)濃度為200 mg/L硝基苯的降解率是60.53%，無(wú)法直接降解400 mg/L的硝基苯。

(3)當(dāng)硝基苯初始濃度低于100 mg/L時(shí)，菌株對(duì)硝基苯的降解符合零級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，相關(guān)系數(shù)為0.981～0.995。硝基苯初始濃度>100 mg/L時(shí)，采用Andrews抑制方程-非競(jìng)爭(zhēng)性底物抑制模型進(jìn)行擬合，模型參數(shù)分別為μmax= 2.059 h-1，KS=54.682 mg/L，Ki=64.138 mg/L。

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Study on Degradation Kinetics of Low-temperature Nitrobenzene Degrading Bacteria

SUN Da-peng

(Liaoning Province Environmental Monitoring Center, Shenyang, Liaoning 110161)

[Objective] The research aimed to study degradation kinetics of low-temperature nitrobenzene degrading bacteria. [Method] The optimal growth condition of low-temperature nitrobenzene degrading bacteria, and its growth and degradation situations under different initial concentrations of nitrobenzene were inspected, and its degradation kinetics was studied. [Result] Under the condition of temperature 15 ℃, pH 7, rotation speed 140 r/min and inoculum amount 10%, it was optimal for the bacteria growth. After cultivated for 48 h, degradation rate of 200 mg/L nitrobenzene by the bacteria reached 60.53%. When initial nitrobenzene concentration was more than 100 mg/L, degradation kinetics of the bacteria corresponded to Andrews inhibition equation-non-competitive substrate inhibition model. [Conclusion] The research could provide theoretical basis for biological treatment of actual nitrobenzene wastewater.

Nitrobenzene;Acinetobacterbaumannii; Biological degradation; Kinetics

孫大鵬(1977-)，男，遼寧沈陽(yáng)人，碩士，從事環(huán)境污染源監(jiān)控管理研究。

2015-02-09

S 181.3;X 172

A

0517-6611(2015)09-243-03