流式細(xì)胞儀分離工作犬XY精子的研究

韋云芳，張躍駿，唐樹(shù)生，陳方良，程魯光，黎立光，劉 慶，杜曉鵬，毛愛(ài)國(guó)，汪 斌，萬(wàn)九生*

(1.公安部昆明警犬基地，云南昆明 650204； 2.警犬技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650204；3.公安部警犬技術(shù)學(xué)校，遼寧沈陽(yáng) 110034)

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流式細(xì)胞儀分離工作犬XY精子的研究

韋云芳1,2，張躍駿1，唐樹(shù)生1,2，陳方良1,2，程魯光1,2，黎立光2，劉 慶3，杜曉鵬1,2，毛愛(ài)國(guó)1,2，汪 斌1,2，萬(wàn)九生1,2*

(1.公安部昆明警犬基地，云南昆明 650204； 2.警犬技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650204；3.公安部警犬技術(shù)學(xué)校，遼寧沈陽(yáng) 110034)

[目的] 探索適用于犬性別控制的流式細(xì)胞儀分離精子的方法。[方法] 采集昆明犬和德國(guó)牧羊犬的精液，采用不同濃度(6、8、10、12 μl/ml)的Hoechst 33342對(duì)精液進(jìn)行染色，探討不同濃度的熒光染料Hoechst 33342及公犬個(gè)體對(duì)精子分離效果的影響。[結(jié)果]當(dāng)Hoechst 33342濃度分別為6、8、10 μl/ml時(shí)，X和Y精子的DNA差異不能被分辨成雙峰，只有當(dāng)Hoechst 33342為12 μl/ml時(shí)，X/Y雙峰能有效并穩(wěn)定地分離。不同公犬的鮮精死精率與X/Y精子分離速度呈明顯負(fù)相關(guān)性，而分離準(zhǔn)確率則與鮮精死精率無(wú)明顯相關(guān)性。[結(jié)論] 當(dāng)Hoechst 33342濃度為12 μl/ml時(shí)，流式細(xì)胞儀能將警犬X、Y精子成功分離。選擇適宜的種公犬對(duì)提高精子的分離效率和分離精液的品質(zhì)都有重要意義。

流式細(xì)胞儀；犬； XY精子分離；性別控制

性別控制技術(shù)(Sexing technology)是指人為干預(yù)動(dòng)物的正常生殖活動(dòng)，使動(dòng)物能夠按照人們的意愿繁衍所需性別后代的一種繁殖技術(shù)。動(dòng)物性別控制對(duì)人類而言是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)，同時(shí)具有潛在的重大利用價(jià)值。在人類，后代性別的選擇可以有效避免性別連鎖遺傳疾病的發(fā)生[1-2]。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，動(dòng)物許多重要經(jīng)濟(jì)性狀都與性別密切相關(guān)，通過(guò)性別控制技術(shù)不僅能使特定性別的家畜發(fā)揮其性別相關(guān)的生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)，獲得最大的經(jīng)濟(jì)效益，而且在繁育工作中可以加快品種改良進(jìn)程，提高育種效率[3-5]。另外，性別控制技術(shù)對(duì)瀕危動(dòng)物及野生珍稀動(dòng)物資源的保種、繁殖擴(kuò)群及遺傳科學(xué)的發(fā)展都具有十分重要的意義[6-7]。

目前，常見(jiàn)的動(dòng)物性別控制方法主要有2類：受精后早期胚胎的性別鑒定技術(shù)和受精前X、Y精子的分離技術(shù)[8]。其中，在受精前分離X、Y精子是比較理想的、根本的性別控制方式[9]。長(zhǎng)期以來(lái)，根據(jù)雄性動(dòng)物的X、Y精子在體積、密度、電荷、運(yùn)動(dòng)性和表面抗原等方面存在的差異，依靠物理、化學(xué)和生物學(xué)的原理，人們也嘗試了多種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)精子的分離[10-13]。在眾多的精子分離方法中，流式細(xì)胞儀分離法是目前最可靠且高效的X、Y精子分離方法[14-17]。作為新涌現(xiàn)出的一種輔助生殖技術(shù)，流式細(xì)胞儀分選精液技術(shù)是基于X和Y染色體間DNA含量的微小差異(X精子的DNA含量比Y精子多3%～5%)[15]，利用這種差異，采用能與DNA特異結(jié)合的熒光染料Hoechst 33342，以熒光染色后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)的X、Y精子所發(fā)射熒光強(qiáng)度的差別來(lái)判定X、Y精子的不同并使其分流，從而達(dá)到分離的目的[18-19]。

使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行精液X、Y精子分離也是唯一在應(yīng)用上取得進(jìn)展的技術(shù)，在牛的性別控制中該技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用[20]。奶牛業(yè)中應(yīng)用流式細(xì)胞儀分離的X精子冷凍精液人工授精在生產(chǎn)中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，產(chǎn)母犢率可達(dá)90%以上。另有多種家畜已采用精液性別分選技術(shù)成功產(chǎn)出預(yù)控性別的后代，如豬、羊、馬[21]。為了擴(kuò)大精液分選技術(shù)的研究與應(yīng)用，多種瀕危和珍稀的野生哺乳動(dòng)物的精液被有效分離，如靈長(zhǎng)類[22]、海豚[23]、羊駝[24]、大象[25]、水牛[26]、犀牛[27]等。

在犬上，精液分選技術(shù)的研究與發(fā)展同樣能夠帶來(lái)廣泛的應(yīng)用和巨大的利益。精液分選技術(shù)與精液冷凍保存技術(shù)、人工授精(AI)技術(shù)的結(jié)合，對(duì)于商業(yè)化寵物犬、純種犬的繁育意義重大[28]。在警用工作犬領(lǐng)域，犬的專業(yè)方向與工作性能常常與其性別緊密相關(guān)，該技術(shù)的應(yīng)用能使繁育工作者根據(jù)實(shí)際需要(工作方向或保種)選擇工作犬的性別，以提高工作犬繁育的工作效率和工作犬的實(shí)戰(zhàn)作用，加快工作犬品種改良的步伐。目前，有關(guān)犬X、Y精子分離的研究報(bào)道十分匱乏，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。國(guó)外Meyers等[29]曾報(bào)道應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選精液產(chǎn)下拉布拉多犬性控后代，但缺乏更多關(guān)于分選過(guò)程的研究報(bào)道。Rodenas等[30]則對(duì)5個(gè)品種的犬(金毛獵犬、法國(guó)斗牛犬、伊比贊獵犬、魏瑪犬及蘇格蘭梗)進(jìn)行了流式細(xì)胞儀分選精液的研究，但不同品種犬、不同環(huán)境與試驗(yàn)條件下精子分離效果差異較大，其報(bào)道的分選條件不一定適合我國(guó)環(huán)境條件下不同品種犬的精液分選。筆者探索利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行國(guó)內(nèi)繁育飼養(yǎng)的警用工作犬(昆明犬和德國(guó)牧羊犬)X、Y精子分離的技術(shù)體系，以期為工作犬及其他犬種的性別控制技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備流式細(xì)胞儀(MoFlo-SX,DakoCytomation Inc.,Fort Collins,CO,USA)、單頭精液灌裝機(jī)(法國(guó)IMV)、精子密度儀(AccuCell，法國(guó)IMV)、超聲波細(xì)胞破碎儀、倒置熒光相差顯微鏡、冷凍離心機(jī)、恒溫水浴槽、液氮罐等。

1.2 主要試劑與藥品Hoechest 33342(Sigma,St.Louis,MO,USA)、Food Colouring Dye(FD&C#40; Warner Jenkinson Company Inc.,St.Louis,MO,USA)、配液(改良TALP稀釋液、分離鞘液、精子接收液、Tris A/B凍存液等)所用試劑及其他試劑除特別指出外，均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)中所用公犬分別來(lái)自公安部昆明警犬基地(昆明犬)和山東省公安廳警犬基地(德國(guó)牧羊犬)健康、正常使用的種公犬。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1不同的Hoechst 33342濃度對(duì)X、Y精子分辨率的影響。該試驗(yàn)的目的是研究不同的Hoechst 33342染料濃度對(duì)精子分離時(shí)X精子和Y精子DNA飽和分辨率的影響。在精子染色體系(1 ml，體系中精子染色后終濃度為1×108個(gè)/ml)中分別加入6、8、10、12 μl的Hoechst 33342(5 mg/ml)染色液進(jìn)行染色。以流式細(xì)胞儀檢測(cè)定向正確精子的X峰和Y峰的分辨情況為評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.2公犬鮮精質(zhì)量對(duì)分離效果的影響。該試驗(yàn)旨在探討來(lái)自同一種公犬的不同密度、活率的精液對(duì)精子分離效率和分離效果的影響，主要考察指標(biāo)有分離過(guò)程中的死精率、分離速度和分離準(zhǔn)確率等。

1.4.3不同個(gè)體公犬精子分離效果的比較。該試驗(yàn)利用流式細(xì)胞儀對(duì)不同個(gè)體公犬精液的分離效果進(jìn)行了分析，初步探討經(jīng)流式細(xì)胞儀分離的6頭種公犬精液在分離過(guò)程中的死精率、分離速率和分離準(zhǔn)確率等分離指標(biāo)的差異。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1精液采集和處理。采集的鮮精恒溫保存于21 ℃車載冰箱中，并盡快送交山東奧克斯生物技術(shù)公司精子分選實(shí)驗(yàn)室。在顯微鏡下評(píng)估精子活力、活率及形態(tài)正常率等指標(biāo)，使用精子密度儀測(cè)定精子密度。在室溫(22～23 ℃)條件下將原精與稀釋液(改良TALP液)以1∶2(V/V)比例稀釋后，2 200 r/min離心10 min，棄掉上清并重新加入一定量的稀釋液，將精液濃縮到5×108個(gè)/ml以上。

1.5.2精子的染色。根據(jù)濃縮后精子的密度，計(jì)算出染色時(shí)所要加入稀釋液和精液的量。按順序向5 ml分離管中分別加入12 μl Hoechst 33342熒光染料(5 mg/ml)、稀釋液、精液(總體積為1 ml)，混勻后在34 ℃水浴避光孵育，每隔15 min搖晃1次，以保證精子染色的一致性。經(jīng)50 min的水浴孵育后，再加入同溫同體積的Food coloring染液(含有4%卵黃和0.002%的食物染料)，最終精子濃度為1×108個(gè)/ml，然后將精液經(jīng)50 μm孔徑的濾器過(guò)濾。

1.5.3使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行精子分離。過(guò)濾后的染色精子盡快使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行X、Y精子分離。分離條件：鞘液(含0.1% BSA和0.1% EDTA的PBS)壓力37 Psi，激光照射強(qiáng)度175 mW。分離精子收集在50 ml的離心管中，離心管中預(yù)先加入約2 ml接收液(Tris A稀釋液)。當(dāng)分離時(shí)間達(dá)到30 min或分離精子數(shù)量達(dá)到50萬(wàn)個(gè)時(shí)，輕輕搖晃收集管，以使搖勻精子和卵黃。分離后的精子進(jìn)行冷凍保存，最終投入液氮保存。

1.5.4分離精子的準(zhǔn)確率評(píng)估。解凍后的分選精液測(cè)定活率后，采用流式細(xì)胞儀重分析法測(cè)定分離精子的準(zhǔn)確率。具體操作為：取5 ml分離管，先加入12 μl熒光染料，再加入1 ml Tris鞘液(pH 8.0)，最后將解凍后精液加入管內(nèi)，精液體積不低于20 μl。上下顛倒搖晃幾次(注意動(dòng)作要輕)，放入34 ℃水浴鍋溫育20 min。溫育完成后，用超聲波處理分離后精子(脈沖設(shè)為6，時(shí)間為1 s)，調(diào)整好儀器進(jìn)行再分離，根據(jù)軟件要求計(jì)算出分離樣品X、Y精子的準(zhǔn)確度。

1.5.5數(shù)據(jù)的記錄與統(tǒng)計(jì)分析。在精子上機(jī)分離過(guò)程中，記錄儀器上顯示的每份精液樣品的分離參數(shù)(包括分離速率和死精率)，應(yīng)用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05表示差異顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 X、Y精子在不同的染料濃度下DNA含量差異的分辨結(jié)果引入“分效”(分效 = 雙峰交疊處高度/整個(gè)峰高)這個(gè)概念來(lái)更好地說(shuō)明XY精子DNA含量差異的分辨效果(圖1)。分效數(shù)值越小，表示X、Y精子的分離效果越好；反之，則表示分離效果不佳。分效數(shù)值最大為1，表示X精子和Y精子的DNA含量雙峰交疊，不能分辨。

精液樣品上機(jī)分離結(jié)果顯示，犬精子在Hoechst 33342加入量分別為6、8和10 μl的染料濃度下不能有效地將X精子和Y精子根據(jù)DNA含量的差異分辨成雙峰，或雙峰的分離并不穩(wěn)定，剛上機(jī)充壓瞬間進(jìn)入流式細(xì)胞儀檢測(cè)的精子數(shù)量較多，能見(jiàn)微弱分效(約0.8～0.9)，但隨著進(jìn)樣量的減少，XY精子幾乎不能分離，分效約為1。當(dāng)染料加入量為12 μl時(shí)，雙峰能有效并穩(wěn)定分離，分效約為0.25～ 0.75，平均分選速度約為2 000個(gè)/s。

2.2 精液的分選結(jié)果多頭種公犬的精液通過(guò)初步試驗(yàn)，但只有6頭種公犬的精液能夠上機(jī)分選，共獲得分選凍精約120支，分選速度約為1 400～2 500個(gè)/s。經(jīng)純度檢測(cè)，X、Y精子分選的準(zhǔn)確率約為90%～ 92%。精子上機(jī)分選圖例圖2A～C，分選精子純度分析圖見(jiàn)圖2D～E。

2.3 公犬鮮精質(zhì)量對(duì)分離效果的影響影響精子分離速度和效果的因素很多，流式細(xì)胞儀自身的硬件設(shè)施、調(diào)試狀態(tài)、鞘液壓力、精液品質(zhì)、染色效果等都將對(duì)其產(chǎn)生影響。該試驗(yàn)在其他條件基本一致的前提下重點(diǎn)對(duì)同一種公犬不同密度、活率精子的分離效果進(jìn)行比較。由表1可知，精液密度大、活率好，分離效果越好，分離速度越快。分離準(zhǔn)確率與精液品質(zhì)關(guān)系不大。這是因?yàn)榉蛛x準(zhǔn)確率更多取決于分離時(shí)儀器的調(diào)整狀態(tài)、所取區(qū)域的百分比及噴嘴等其他因素。

2.4 不同公犬精子分離效果的比較筆者對(duì)6頭種公犬精子的分離效果進(jìn)行了比較。從表2可以看出，不同個(gè)體公犬個(gè)體的精液分離速率、死精率存在較大差異。然而，種公犬的精液品質(zhì)雖然會(huì)影響精子的分離效率，但對(duì)分離準(zhǔn)確率的影響不大。精液品質(zhì)越好，死精率越低，精子的分離速率越快。因此，選擇適宜的種公犬對(duì)于提高精子的分離效率和分離精液的品質(zhì)都有著重要的意義。

3 討論與結(jié)論

該研究屬國(guó)內(nèi)首次報(bào)道使用流式細(xì)胞儀對(duì)犬XY精子的分離，并成功獲得高純度的X和Y性控精液，犬XY精子的成功分離和冷凍保存將為犬性別控制的研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

3.1 流式細(xì)胞儀分離犬精子試驗(yàn)條件的探索使用流式細(xì)胞儀分離精子是目前最成功的哺乳動(dòng)物精子分離方法，其依據(jù)哺乳動(dòng)物X精子的DNA含量比Y精子多的原理，通過(guò)Hoechst 33342熒光染料對(duì)精子的DNA飽和著色，在精子通過(guò)流式細(xì)胞儀時(shí)根據(jù)這個(gè)細(xì)微的熒光差別將X和Y精子分離[31]。因此，合適的染料濃度是進(jìn)行精子分離首先要確定的分離指標(biāo)。若染料濃度過(guò)低，當(dāng)反應(yīng)的Hoechst 33342沒(méi)有達(dá)到飽和DNA所需濃度時(shí)，不同的精子因?yàn)樽陨砩砩町惗Y(jié)合上不等量的染料，這些不等量的結(jié)合而導(dǎo)致的差異掩蓋了X和Y精子之間DNA的差異，因而雙峰不能分辨；當(dāng)Hoechst 33342超過(guò)飽和DNA所需濃度時(shí)，結(jié)合上的量與恰巧飽和時(shí)的量并沒(méi)有顯著差異，因而雙峰分辨的程度也將不會(huì)有明顯改變。只有在合適的染色濃度下X/Y精子恰恰能飽和著色，才能進(jìn)行有效分離[32]。該試驗(yàn)結(jié)果表明，在Hoechst 33342加入量為12 μl染色條件下，犬XY精子能得以有效分離。然而，高濃度熒光染料的染色會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生損害作用。因此，在精子分離過(guò)程中為確保生物安全性，應(yīng)盡可能在分辨率允許的情況下使用低濃度的熒光染料對(duì)精液樣本進(jìn)行處理。由于該試驗(yàn)中設(shè)計(jì)的梯度濃度(6、8、10、12 μl)跨度相對(duì)較大，今后可以嘗試縮小濃度梯度，摸索出適合犬精子分離的較低濃度的染料條件。

表1 公犬精子活力對(duì)X/Y精子分離效果的影響

表2 不同公犬精子分離效果比較

另外，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其他染色條件(如水浴溫度、水浴時(shí)間)也會(huì)對(duì)精子質(zhì)量和精子的分離產(chǎn)生一定的影響，水浴溫度過(guò)高，水浴時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，精子的分離越不穩(wěn)定，對(duì)精子質(zhì)量的不利影響也越大。目前，34 ℃水浴條件下水浴50 min是比較理想的染色條件。

除以上影響XY精子有效分離的重要因素外，另一重要影響因素可能是犬本身的身體素質(zhì)和生理狀況、犬個(gè)體之間以及個(gè)體不同的時(shí)間、環(huán)境下生精狀況的差異。如同一頭犬隨著季節(jié)和環(huán)境的變化會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致體內(nèi)精子濃度和精漿物質(zhì)發(fā)生變化，引起精子生理生化結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而導(dǎo)致分離過(guò)程中所需分離條件的差異，如染色中Hoechst 33342飽和DNA難易程度的差異等。該研究報(bào)道的Hoechst 33342有效分離濃度與Rodenas等[30]所報(bào)道的有效染色濃度有較大差異，其具體的影響因素和機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。3.2 犬精子的分選理論上，犬XY精子的DNA含量差異較大(3.9%)，應(yīng)較易于分選。該研究結(jié)果表明，犬精子分選后主要指標(biāo)都能夠基本滿足低劑量人工授精(AI)的要求。冷凍后重分析發(fā)現(xiàn)，X、Y精子純度分別達(dá)到90%和92%，是分選成功的直接指標(biāo)之一。雖然此次試驗(yàn)成功獲得了犬冷凍XY精子，但分離效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于奶牛，主要原因可能包括：①犬精液濃度較牛低，保存運(yùn)輸后活力差；②種公犬一次采集的精液總量較低；③大部分分選參數(shù)是參照牛的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定的，因此將來(lái)通過(guò)改良和優(yōu)化犬精子分選參數(shù)可能會(huì)進(jìn)一步提高其分離效率。

3.3 犬分選精子的應(yīng)用流式細(xì)胞儀分離精子技術(shù)若與體外受精和顯微受精等輔助生殖技術(shù)相結(jié)合，將有巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景。然而，高分選費(fèi)用是限制該技術(shù)應(yīng)用的主要因素。以奶牛業(yè)為例，國(guó)內(nèi)用于奶牛性別控制的分離精子已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)，含200～250萬(wàn)精子、活率0.5的每支0.25 ml細(xì)管售價(jià)為200～300元。因此，分離精子目前僅限于少數(shù)科研和育種場(chǎng)應(yīng)用，其推廣仍受到很大限制。隨著儀器的改善、分選效率和低劑量輸精技術(shù)水平的提高以及相應(yīng)成本的降低，XY精子分離的性別控制技術(shù)必將得到更為廣泛的應(yīng)用與推廣。另外，隨著研究人員對(duì)犬越來(lái)越多的關(guān)注及犬生殖技術(shù)研究的深入與發(fā)展，犬分選精液必將在警犬和其他犬業(yè)繁育中獲得廣泛應(yīng)用。

利用流式細(xì)胞儀分離犬精子進(jìn)行性別控制的方法是可行的，對(duì)犬使用流式細(xì)胞儀分離法和冷凍技術(shù)成功獲得了高純度冷凍的X、Y精子。該精子分離技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、思路新穎、方法獨(dú)特、準(zhǔn)確率高、便于推廣等特點(diǎn)。雖然目前流式細(xì)胞儀分離法也存在劣勢(shì)(如分離精子的速度較慢、儀器價(jià)格昂貴、分離成本高等)，但隨著儀器的改進(jìn)和各項(xiàng)輔助生殖技術(shù)的深入研究、發(fā)展，性控精液必將在警犬及其他犬種的生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用，產(chǎn)生巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

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Study on the Sperm Sex-sorting of Working Dogs by Flow Cytometry

WEI Yun-fang1,2,ZHANG Yue-jun1, TANG Shu-sheng1,2,WAN Jiu-sheng1,2*et al

(1.Kunming Police Dog Base of Ministry of Public Security,Kunming,Yunnan 650204; 2.Key Laboratory of Police Dog Technology,Ministry of Public Security,Kunming,Yunnan 650204)

[Objective] The research aimed to explore the sex-sorting method of canine spermatozoa by using flow cytometry.[Method] The semen samples were collected from Kunming dogs and German shepherd dogs and stained with different concentrations (6,8,10 and 12 μl/ml) of Hoechst 33342.The influences of different concentrations of Hoechst 33342 and different dog individuals on the sex-sorting efficiency were discussed.[Result] When the concentrations of Hoechst 33342 was 6, 8, 10 μl/ml,fresh canine sperm could not be effectively separated.When the concentration of Hoechst 33342 was 12 μl/ml,fresh canine sperm could be effectively and stably separated.The death rate of sperm in fresh semen of different male dogs showed an obvious negative correlation with the sex-sorting speed,but the sex-sorting accuracy had no obvious correlation with the death rate of sperm in fresh semen.[Conclusion] When the concentration of Hoechst 33342 was 12 μl/ml,the sex-sorting of canine spermatozoa could be successfully performed by using flow cytometry.It was of great significance for improving the sex-sorting efficiency of sperm and the quality of separated sperm to select suitable male dog.

Flow cytometry; Canine; Sperm sorting; Sex control

公安部應(yīng)用創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2011YYCXKMJQ167)。

韋云芳(1986- )，女，云南保山人，助理研究員，碩士，從事警犬分子遺傳育種。張躍駿(1978- )，男，江西吉安人，助理研究員，碩士，從事警犬技術(shù)研究。韋云芳與張躍駿為同等貢獻(xiàn)作者。*通訊作者，副研究員，碩士，從事警犬輔助繁殖生物技術(shù)研究與應(yīng)用。

2015-02-02

S 865.3+1

A

0517-6611(2015)09-095-04

鳴 謝衷心感謝山東省公安廳警犬基地和山東濟(jì)南奧克斯生物技術(shù)公司對(duì)該研究的大力支持！