貴州野生甜藤多糖的提取與脫蛋白方法研究

常 飛，王紹云，陳 飛

1 凱里學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，凱里 556011;2 貴州大學(xué)精細(xì)化工研究中心，貴陽(yáng) 550025

甜藤Paederia Scandens(Lour.)Merr，又名雞屎藤、牛皮凍、斑鳩飯、青風(fēng)藤等，為茜草科甜藤屬多年生草質(zhì)藤本，主要分布于印度、日本、中國(guó)等地。在我國(guó)有廣闊的生長(zhǎng)區(qū)域，主要分布于長(zhǎng)江流域及其南部地區(qū)［1，2］。甜藤作為民間常用草藥已有數(shù)千年歷史，主治療風(fēng)濕疼痛，腹瀉痢疾，骯腹疼痛，氣虛浮腫，頭昏食少，肝脾腫大，瘰疬，腸癰，無(wú)名腫毒，跌打損傷等［3］，近年研究發(fā)現(xiàn)雞屎藤水提取液具有較強(qiáng)的抑菌作用［4-7］，用于治療消化系統(tǒng)疾病療效獨(dú)特。在貴州雞屎藤既是苗族習(xí)用藥材，又是貴州侗族人民喜歡的野生蔬菜，是貴州“甜藤粑”、“侗果”等傳統(tǒng)特色美食的主要原料。甜藤嫩莖含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如抗壞血酸、膳食纖維、胡蘿卜素、多種礦物質(zhì)和多種氨基酸［8］。此外，甜藤中還含有一些生物活性物質(zhì)如多糖(或甙類(lèi))、黃酮及其甙類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)等［9］。而大量文獻(xiàn)證實(shí)植物多糖具有廣泛的生物活性，如增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗細(xì)菌活性、降血脂、降血糖、抗衰老等作用，已經(jīng)應(yīng)用到保健品、藥品、食品和化妝品等領(lǐng)域。植物多糖常混有較多蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)存在不僅可能影響其生理活性和多糖的結(jié)構(gòu)，且可能導(dǎo)致藥理作用下降。近年來(lái)，對(duì)甜藤植物的研究主要是對(duì)其化學(xué)成分和臨床應(yīng)用等方面，而對(duì)其中多糖的提取及脫蛋白方法的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，因此對(duì)甜藤多糖的研究具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)以貴州野生甜藤為原料，對(duì)甜藤多糖的提取條件和甜藤粗多糖脫蛋白方法進(jìn)行研究，以確定甜藤多糖最佳提取條件和脫蛋白方法，為貴州野生甜藤資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜藤于2013 年5 月采自貴州凱里。經(jīng)本院周江菊教授鑒定為茜草科雞屎藤屬多年生蔓性草質(zhì)藤本植物［Paederia scandens(Lour.)Meer.］。將新鮮甜藤嫩莖在60 ℃下干燥至恒重，粉碎，過(guò)40 目篩，作為甜藤多糖提取實(shí)驗(yàn)材料。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度為99.9%，美國(guó)Sigma 公司)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水。蒽酮試劑:稱取0.2 g 蒽酮加入到100 mL 濃硫酸中，攪拌使其溶解、冷卻，即得蒽酮試劑，轉(zhuǎn)入棕色瓶中(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

UV-2550 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司;SG250HDT 超聲波清洗器，由上海冠特生產(chǎn);TGL-16C 高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海雅萊生化儀器設(shè)備有限公司;ZK-82A 型真空干燥箱，上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠;多功能粉碎機(jī)，北京科偉永興儀器有限公司;AR2140型電子分析天平，由奧斯國(guó)際貿(mào)易有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及甜藤多糖含量的測(cè)定

采用蒽酮-硫酸法［10，11］，準(zhǔn)確稱取23.3 mg 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL 容量瓶中，加蒸餾水溶解，定容并搖勻，此時(shí)濃度為0.233 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。取6 只10 mL 具塞試管，分別精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL，分別補(bǔ)水至1.00 mL，加入蒽酮試劑4 mL，搖勻，同時(shí)置于沸水浴中加熱10 min，取出流水冷卻后，常溫下靜置10 min。以首管為空白于620 nm 處測(cè)定吸光度。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:y=8.9571x+0.0317，R2=0.9991，結(jié)果葡萄糖質(zhì)量濃度在0.0233～0.1165 mg/mL 范圍內(nèi)與吸光度值具有很好的線性關(guān)系。

精確吸取待測(cè)液2.00 mL，加入蒽酮試劑4 mL，同標(biāo)準(zhǔn)曲線之操作，測(cè)定吸光度值。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定甜藤樣品中多糖含量。

1.2.2 蛋白脫除率和多糖損失率的測(cè)定

1.2.2.1 蛋白脫除率的測(cè)定

吸取粗多糖溶液1.00 mL 于25 mL 量瓶中，加蒸餾水稀釋定容，搖勻，得稀釋液。以蒸餾水為參比，測(cè)定稀釋液在260 nm 和280 nm 處的吸光度。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式:蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)=1.45×A280-0.74×，算得蛋白質(zhì)含量，從而計(jì)算蛋白脫除率。

蛋白脫除率=［(m1-m2)/m1］×100%

式中:m1為粗多糖溶液中蛋白質(zhì)量;m2為除蛋白后多糖溶液中蛋白質(zhì)量。

1.2.2.2 多糖損失率的測(cè)定

利用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定脫蛋白前后甜藤粗多糖溶液中多糖含量，從而計(jì)算多糖的損失率。

多糖損失率=［(m3-m4)/m3］×100%

式中:m3為粗多糖溶液中多糖質(zhì)量;m4為脫蛋白后多糖溶液中多糖質(zhì)量。

1.2.3 甜藤多糖提取工藝探究

1.2.3.1 提取工藝流程

新鮮甜藤莖→洗滌干凈→干燥→粉碎→過(guò)40目曬→用水為提取溶劑→超聲輔助提取→減壓過(guò)濾→濾渣再重復(fù)提取1 次→合并過(guò)濾→旋蒸濃縮→加入無(wú)水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)80%→4 ℃冰箱中靜止24 h→以4000 rpm 離心10 min→抽濾收集沉淀→用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌沉淀→真空干燥→粗多糖。取甜藤粗多糖約0.1 g→精密稱定→蒸餾水溶解→定容500 mL→搖勻→得甜藤粗多糖溶液。

1.2.3.2 單因素試驗(yàn)

多糖的提取參閱文獻(xiàn)［13，14］方法改進(jìn)，水是最好的溶劑，超聲輔助提取法比回流提取法簡(jiǎn)便且快速，本研究采用超聲輔助提取法。影響植物多糖提取效果較為顯著的因素主要是料液比、水浴溫度、超聲提取時(shí)間、超聲功率，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)探究其影響水平。

1.2.3.3 正交試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.2.4 甜藤多糖脫蛋白方法研究

1.2.4.1 Sevag 法［15］

取甜藤粗多糖溶液50 mL，加入1/5 體積的Sevag 試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1，V/V)，劇烈振搖20 min，轉(zhuǎn)入分液漏斗中，靜止至分層去除交界處變性蛋白質(zhì)和下層有機(jī)相，保留上層水相以4000 rpm 離心15 min，得脫蛋白處理液，測(cè)定波長(zhǎng)260 nm、280 nm 處蛋白吸收峰，比較除蛋白效果。取4 份粗多糖溶液，按前述步驟分別處理1、2、3、4 次，按“1.2.2.1項(xiàng)、1.2.2.2 項(xiàng)”測(cè)定不同處理次數(shù)后蛋白脫除率和多糖損失率。

表1 正交試驗(yàn)的因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.4.2 三氯乙酸(TCA)法［16，17］

取甜藤粗多糖溶液6 份，各50 mL，分別加入等體積的各種濃度的三氯乙酸水溶液，依次為4%、6%、8%、10%、12%、14%，充分震蕩至溶液不再渾濁，放置1.5 h，以4000 r/min 離心15 min，棄去沉淀，上清液滴加NaOH 飽和溶液，使溶液pH 為7.0，測(cè)定蛋白脫除率和多糖損失率。首先考察哪種濃度的三氯乙酸溶液脫蛋白效果最好，然后再試驗(yàn)脫蛋白處理次數(shù)。

1.2.4.3 TCA-Sevag 法［17］

取甜藤粗多糖溶液50 mL，加入50 mL10%TCA 溶液和10 mL 氯仿-正丁醇(4∶1)溶液，攪拌1 h，4000 rpm 離心15 min，去除交界處變性蛋白質(zhì)，取上清液(水相)，測(cè)定蛋白脫除率和多糖損失率。按照前述方法考察TCA-Sevag 法脫蛋白次數(shù)的效果。

1.2.4.4 HClO4法

取甜藤粗多糖溶液6 份，各50 mL，以1∶1(V/V)分別加入不同濃度(1%、2%、3%、4%、5%、6%)高氯酸溶液，搖勻至溶液不再渾濁，靜置30 min，4000 rpm 離心10 min，取上清液，用NaOH 飽和溶液調(diào)節(jié)溶液pH 至7.0，測(cè)定蛋白脫除率和多糖損失率。考察不同濃度高氯酸溶液脫蛋白情況，確定最佳濃度后，考察高氯酸法處理1、2、3、4 次后的脫蛋白效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 甜藤多糖提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)甜藤多糖提取效果的影響

在超聲功率80 W，水浴溫度50 ℃，超聲60 min條件下，探索料液比對(duì)甜藤多糖提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1A。

由圖1A 可知，多糖得率隨料液比的增加，剛開(kāi)始增加很明顯后緩慢增加，當(dāng)料液比由1∶40 增加到1∶50 時(shí)多糖得率只增加了0.006%，從節(jié)約方面考慮，故選擇1∶30、1∶40 和1∶50 三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)甜藤多糖提取效果的影響

在超聲波功率80 W，水浴溫度50 ℃，料液比1∶40(m/V)的條件下，探索超聲提取時(shí)間對(duì)甜藤多糖提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1B。

由圖1B 可知，當(dāng)超聲提取時(shí)間達(dá)到110 min 時(shí)多糖得率達(dá)到最高，再延長(zhǎng)時(shí)間，多糖得率反而下降。說(shuō)明有少部分多糖被降解了，可能由于超聲波的空化效益和強(qiáng)烈的機(jī)械振動(dòng)效應(yīng)，超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使局部溫度和壓強(qiáng)過(guò)大，使多糖發(fā)生變性或結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的大分子多糖斷裂而損失。故選擇70、90 min和110 min 三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.3 水浴溫度對(duì)甜藤多糖提取效果的影響

在超聲功率80 W，超聲提取時(shí)間60 min，料液比1∶40 的條件下，探索水浴溫度對(duì)甜藤多糖提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1C。

由圖1C 可知，隨著水浴溫度的升高，多糖得率不斷增加，溫度由30 ℃到50 ℃階段多糖得率曲線較陡，再升高溫度，多糖得率只是略有升高，但溫度較高時(shí)溶液的稠度增大，考慮到節(jié)約資源和過(guò)濾的難度，故選擇50、60 ℃和70 ℃三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.4 超聲功率對(duì)甜藤總糖提取效果的影響

利用超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)和強(qiáng)烈的機(jī)械振動(dòng)可以加速植物中有效成分進(jìn)入溶劑，料液比1∶40(m/V)，在水浴溫度50 ℃條件下，超聲60 min，探索超聲功率對(duì)甜藤多糖提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1D，隨著超聲功率的增加，多糖增加很明顯，當(dāng)功率達(dá)到80 W 時(shí)，達(dá)到最高，但超聲功率100 W 時(shí)，吸光度反而下降，可能由于超聲波功率過(guò)高使少量多糖降解，故選擇70 W 和80、90 W 三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖1 料液比(A)、超聲時(shí)間(B)、水浴溫度(C)和超聲功率(D)對(duì)多糖提取效果的影響Fig.1 Effects of solid/liquid ratio(A)，ultrasonic time(B)，water bath temperature(C)，ultrasonic power(D)on the extraction yield of polysaccharides

2.2 甜藤多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果

取正交試驗(yàn)所得的樣品溶液，按照1.2.1 項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2 極差R 分析，各因素對(duì)甜藤多糖提取效果影響大小依次排列為:料液比(A)＞超聲時(shí)間(C)＞超聲功率(D)＞水浴溫度(B)，通過(guò)正交試驗(yàn)直觀分析得到最佳提取工藝是:A3B3C3D1。

表2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental program and results

圖2 Sevag 法脫蛋白結(jié)果Fig.2 Deproteinization results using Sevag method

為了驗(yàn)證結(jié)果的可信度。取甜藤樣品約5 g，精密稱取3 份，按正交試驗(yàn)所得的最佳條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定甜藤多糖的平均得率為1.61%(RSD 為0.66%)，結(jié)果說(shuō)明該工藝可行，即原料與溶劑按1∶50(m/V)進(jìn)行混合，在超聲功率70 W、水浴溫度70 ℃下，超聲提取110 min，提取2 次。

2.3 甜藤多糖脫蛋白方法研究結(jié)果

2.3.1 Sevag 法

從圖2 可知，Sevag 法脫蛋白率較低，處理次數(shù)增加，蛋白脫出率和多糖損失率成比例的增加，蛋白脫出率最高只能達(dá)到40.72%，但多糖損失率已達(dá)到51.17%，結(jié)果說(shuō)明了有部分多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合比較牢固，脫出蛋白質(zhì)的同時(shí)，也有部分的多糖被帶走了，所以多糖的損失率也在相應(yīng)的增加。

圖3 不同濃度的TCA 脫蛋白結(jié)果Fig.3 Deproteinization results with different concentrations of TCA

2.3.2 TCA 法

圖4 不同次數(shù)TCA 法脫蛋白的結(jié)果Fig.4 Deproteinization results with different times of TCA

由圖3 可知，用不同濃度三氯乙酸與等體積粗多糖溶液混合進(jìn)行脫蛋白試驗(yàn)，結(jié)果三氯乙酸濃度為15%時(shí)，蛋白脫出率最好73.72%，多糖損失率為16.54%。以最佳的三氯乙酸濃度15%，進(jìn)行多次脫蛋白處理，結(jié)果由圖4 可知，隨著處理次數(shù)的增加，蛋白脫出率增加不多，但是多糖損失較大。

2.3.3 TCA-Sevag 法

圖5 TCA-Sevag 法脫蛋白結(jié)果Fig.5 Deproteinization results using TCA-Sevag method

由圖5 看出，增加處理次數(shù)，多糖損失率較大幅度地增大，而蛋白質(zhì)的去除效果卻基本不變。

2.3.4 HClO4法

圖6 不同濃度的HClO4脫蛋白結(jié)果Fig.6 Deproteinization results with different concentrations of HClO4

圖7 不同次數(shù)HClO4法脫蛋白結(jié)果Fig.7 Results of different times of deproteinization using HClO4method

由圖6、圖7 可知，HClO4法脫除甜藤多糖中蛋白質(zhì)與高氯酸濃度和脫蛋白次數(shù)有關(guān)，當(dāng)加入高氯酸濃度為4%(與粗多糖溶液等體積混合后，混合液中高氯酸濃度為2%)時(shí)，脫蛋白效果最好，經(jīng)3 次脫蛋白處理后，蛋白脫出率達(dá)到94.78%，多糖損失率為15.14%;經(jīng)4 次脫蛋白處理后，蛋白脫出率達(dá)到95.02%，多糖損失率為17.95%，可見(jiàn)，使用高氯酸溶液脫甜藤多糖蛋白，只需3 次處理就能達(dá)到滿意結(jié)果。

2.3.5 四種脫蛋白方法的比較

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)研究，不同方法對(duì)甜藤多糖去除蛋白質(zhì)的效果有較大差別，Sevag 法去除甜藤多糖蛋白的效果最差，且多糖損失大，效率不高;三氯乙酸脫蛋白率較高，多糖損失率較Sevag 法低，但是費(fèi)時(shí)。TCA-Sevag 法雖然處理一次就能得到較好的脫蛋白效果，但所用試劑種類(lèi)多導(dǎo)致成本上升，操作比較繁瑣，而且不容易達(dá)到純化目的，易造成環(huán)境的污染，不可取。HClO4法是最佳的甜藤多糖脫蛋白方法，蛋白脫出率高且多糖損失率小，而且方法簡(jiǎn)單，所用試劑種類(lèi)少，易于提純，且對(duì)環(huán)境友好，易于推廣。

2.3.6 甜藤多糖脫蛋白方法的定性分析

圖8 脫蛋白處理前后的紫外光譜掃描圖Fig.8 UV spectra of samples before and after deproteinization

用HClO4法脫蛋白處理前后，進(jìn)行定性分析，結(jié)果見(jiàn)圖8。從圖8 可知，經(jīng)過(guò)4 次脫蛋白處理后，在260 nm 和280 nm 處只有少量吸收，說(shuō)明大部分蛋白質(zhì)已經(jīng)被去掉，只有與多糖結(jié)合牢固的少量蛋白質(zhì)沒(méi)有被除去。

3 結(jié)論與討論

植物中多糖提取方法有很多，本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助提取甜藤多糖，經(jīng)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得出了貴州野生甜藤多糖的最佳提取工藝:以水為溶劑，料液比1∶50(m/v)，在超聲功率60 W、水浴溫度70℃下，超聲提取時(shí)間110 min，提取2 次，所得提取效率最高為1.61%。該法工藝簡(jiǎn)單可行，可作為甜藤多糖的提取工藝。

目前多糖含量測(cè)定方法最常用的是蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法兩種方法［18-20］，其兩種方法的基本原理是多糖在濃硫酸作用下，水解成單糖，然后脫水生成具有呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的糠醛衍生物，糠醛衍生物可與蒽酮、苯酚試劑發(fā)生反應(yīng)生成有色的化合物，在一定范圍內(nèi)，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于多糖的定量。本實(shí)驗(yàn)采用蒽酮-硫酸法來(lái)測(cè)定脫蛋白前后多糖含量，主要是考慮到該方法測(cè)定條件比較溫和，易控制，線性、重復(fù)性和穩(wěn)定性較高;另外，苯酚-硫酸法對(duì)苯酚的純度要求比較嚴(yán)格，其純度直接影響該實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確度;再者，對(duì)于本實(shí)驗(yàn)來(lái)講，主要還研究了甜藤多糖的脫蛋白方法，從結(jié)果誤差和重現(xiàn)性來(lái)講蒽酮-硫酸法測(cè)定脫蛋白前后多糖含量更為合理準(zhǔn)確。

在目前所查到的文獻(xiàn)中，還未見(jiàn)有關(guān)HClO4法用于去除植物中蛋白質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)參閱文獻(xiàn)［21］基礎(chǔ)上，首次采用高氯酸探究植物多糖脫蛋白效果，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，獲得滿意結(jié)果。HClO4法是一種有效的去除甜藤多糖蛋白質(zhì)的方法，且工藝簡(jiǎn)單，成本低，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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