NIRS 結(jié)合TQ 軟件快速測(cè)定山茱萸中莫諾苷的含量

龔海燕，李 珊，謝彩俠，雷敬衛(wèi)，陳志紅，段小彥，白 雁*

1 河南中醫(yī)學(xué)院，鄭州 450048;2 鄭州市食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州 450007

山茱萸是山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.)的干燥果肉。有補(bǔ)益肝腎，固澀精氣的功效［1］，藥理研究表明它具有免疫調(diào)節(jié)、降低血糖、抗菌、抗炎等作用［2］。山茱萸是常見(jiàn)中成藥如六味地黃丸、金匱腎氣丸等的主要原料，其質(zhì)量直接影響這些藥物的療效和安全性。研究表明，其化學(xué)成分主要含有環(huán)烯醚萜苷、有機(jī)酸等［3］。近代研究表明環(huán)烯醚萜苷類(lèi)為山茱萸中主要有效部位［4］，而莫諾苷屬環(huán)烯醚萜苷類(lèi)，為山茱萸中主要藥效成分，具有苦補(bǔ)健胃和預(yù)防糖尿病性血管病的作用［5］。2010 版《中國(guó)藥典》一部中只對(duì)山茱萸藥材中馬錢(qián)苷成分進(jìn)行了定量分析，然而馬錢(qián)苷只是山茱萸中的主要有效成分之一。且有研究表明馬錢(qián)苷與莫諾苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，在炮制工藝中，二者可能有相互間結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，致使含量升高［6］。所以只測(cè)定馬錢(qián)苷的含量是不能代表山茱萸藥材的質(zhì)量的，因此為了更好地控制山茱萸藥材的質(zhì)量，有必要建立測(cè)定莫諾苷的含量的快速方法。

近紅外光譜(NIRS)分析技術(shù)樣品前處理簡(jiǎn)單、無(wú)損、無(wú)污染，具有傳統(tǒng)分析方法所不具有的優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)廣泛用于中藥材定性判別和定量分析等方面［7，8］。研究表明偏最小二乘法適合中藥復(fù)雜樣品，特別是粉末樣品的定量模型的建立［9，10］。本實(shí)驗(yàn)采用近紅外光譜法與偏最小二乘法相結(jié)合的方法建立了快速測(cè)定山茱萸中莫諾苷的定量分析模型，為大批量山茱萸藥材中莫諾苷的快速測(cè)定提供了一種新的綠色測(cè)定方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Thermo Nicolet 6700 型傅立葉變換近紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Nicolet 公司)，配有InGaAs 檢測(cè)器、外接積分球、樣品旋轉(zhuǎn)器、OMNIC 光譜采集軟件和TQ8.0 分析軟件;Waters2695 高效液相色譜儀(PDA 2996 紫外檢測(cè)器);FW-200 型高速藥材粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);CS101-2D 電熱鼓風(fēng)干燥箱;MTTTLER TOLEDO XP205 十萬(wàn)分之一天平。

1.2 試劑

乙腈、甲醇為色譜純，水為樂(lè)百氏純凈水。莫諾苷對(duì)照品(由成都曼斯特生物科技有限公司提供，純度＞98%)，95 份山茱萸藥材分別來(lái)自河南西峽、浙江、陜西，由河南中醫(yī)學(xué)院陳隨清教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.)。

2 方法與結(jié)果

2.1 近紅外光譜的采集

將山茱萸的干燥樣品粉碎，過(guò)80 目篩，制成粉末樣品，每份粉末樣品取約4 g，放入石英樣品杯中，攤平后以空氣為參比，扣除背景，采集近紅外光譜圖。采集方式:積分球漫反射;掃描區(qū)間:4000～12000 cm-1;分辨率:8 cm-1;掃描次數(shù):32 次;溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度30%～40%。每個(gè)樣品掃描三次，取平均值作為樣品NIR 光譜圖。圖1 是95 份山茱萸樣品的近紅外光譜疊加圖。

圖1 95 份山茱萸樣品的近紅外光譜的疊加圖Fig.1 NIR spectra of 95 Fructus Corni samples

2.2 山茱萸中莫諾苷的含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取莫諾苷對(duì)照品適量，加80%的甲醇制成濃度為151.40 μg/mL 的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品粉末約0.1 g，精密稱(chēng)定，加入具塞錐形瓶中，精密加入80%的甲醇25 mL，稱(chēng)定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件及測(cè)定方法

大連依利特Hypersil ODS C18色譜柱;流動(dòng)相為乙腈-水(11∶89)，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm。進(jìn)樣體積10 μL，以保留時(shí)間定性，峰面積定量，外標(biāo)法計(jì)算。每份樣品平行做2次，以其平均值作為HPLC 參考值。

2.2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密量取標(biāo)莫諾苷準(zhǔn)液0.5、1.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，按2.2.3 項(xiàng)下條件，精密吸取10 μL 分別注入高效液相色譜儀，以峰面積積分值y 為縱坐標(biāo)，莫諾苷的含量x(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，莫諾苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為:y=1.2E+6x-9100.3，R2=0.9998，在7.57～151.40 μg/mL 范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度考察

精密量取151.40 μg/mL 的莫諾苷對(duì)照品溶液10 μL，進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.56%，說(shuō)明該方法精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性考察

取同一樣品，稱(chēng)取6 份，各0.1 g，精密稱(chēng)定，各按2.2.2 項(xiàng)下的制備方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL 進(jìn)樣，測(cè)定莫諾苷的含量，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 值為1.56%。由此可見(jiàn)，采用本方法測(cè)定莫諾苷含量，重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一樣品0.1006 g，按照2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，分別在0、2、4、8、12 h 進(jìn)樣，其莫諾苷的峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.52%，結(jié)果表明莫諾苷在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量(1.35%)的山茱萸約0.1 g，共6 份，分別精密稱(chēng)量對(duì)照品(1.35 mg)，按照

2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定其含量，計(jì)算回收率，得平均回收率為98.56%，RSD 為1.03%。

3 山茱萸藥材中莫諾苷定量模型的建立

對(duì)于復(fù)雜的天然產(chǎn)物的近紅外定量模型的建立，通常采用偏最小二乘法(PLS)。本實(shí)驗(yàn)采用PLS 建立定量分析模型，并選擇不同的預(yù)處理方法和不同的譜段，主因子數(shù)來(lái)建立定量校正模型。建模過(guò)程中常使用R2、RMSECV、RMSEC、RMSEP 為評(píng)價(jià)模型性能優(yōu)良的參數(shù)，其中，R2指校正集樣品由NIR 分析模型得到的預(yù)測(cè)值和參考值之間的相關(guān)性，R2越接近于1，表示分析模型對(duì)校正集預(yù)測(cè)越準(zhǔn)確。RMSEC 指校正集樣品由NIR 分析模型得到的預(yù)測(cè)值和參考值之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差，RMSEC 值越小，說(shuō)明所建模型對(duì)校正集預(yù)測(cè)效果越好［4］。RMSECV指模型通過(guò)內(nèi)部交叉驗(yàn)證得到的校正標(biāo)準(zhǔn)偏差，體現(xiàn)模型的整體性能，RMSECV 值越小，校正集樣品的預(yù)測(cè)結(jié)果越接近參考值。RMSEP 指驗(yàn)證集樣品的NIR 預(yù)測(cè)值與參考值之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差，RMSEP 值越小，驗(yàn)證集樣品的預(yù)測(cè)結(jié)果越接近參考值。

3.1 山茱萸樣品的選擇

從收集到的的95 份樣品中，根據(jù)其莫諾苷含量分布，選取78 個(gè)有代表性的樣品組成校正集，剩余17 個(gè)樣品為驗(yàn)證集。如表1 列出了校正集和驗(yàn)證集樣品莫諾苷含量分布范圍及其統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

表1 校正集與驗(yàn)證集中莫諾苷的含量分布Table 1 Content distribution of calibration and validation set for morroniside

3.2 光譜的預(yù)處理

原始NIR 圖譜(圖1)可以看出，樣品的平均近紅外光譜極為相似，難以直接找出特征吸收帶將其區(qū)分。此外，近紅外光譜圖有明顯的散射漂移，且光譜信號(hào)易受樣品粒度大小、密實(shí)度、噪音及光散射等因素影響。為了有效的消除各種噪音及測(cè)量誤差對(duì)分析造成干擾，進(jìn)而突顯光譜中有用信息，研究中首先將原始圖譜進(jìn)行預(yù)處理。

由表2 以看出采用二階導(dǎo)數(shù)(SD)+標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換標(biāo)量(SNV)+卷積平滑(SG)處理的光譜所建立的PLS 定量分析模型的R2為0.9845，為所建模型中最高，RMSEC、RMSECV 和RMSEP 分別為0.109、0.2641 和0.233，均為所建模型中最低，說(shuō)明模型的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、擬合度和預(yù)測(cè)能力均相對(duì)較好，因此選定該光譜預(yù)處理?xiàng)l件為最佳條件。

表2 不同光譜預(yù)處理方法對(duì)建模的影響Table 2 The effects of different preprocessing methods on model development

3.3 建模譜段的選擇

由于樣品近紅外光譜譜峰重疊嚴(yán)重，用常規(guī)的線(xiàn)性分析方法無(wú)法分析。但經(jīng)由二階導(dǎo)數(shù)處理后，其吸收峰會(huì)變得尖銳，有效信息譜段更加明顯。由表3 比較結(jié)果可以看出最佳建模波段為4011.21～8000.00 cm-1。圖3 為樣品在上述處理?xiàng)l件下的近紅外光譜的二階導(dǎo)數(shù)圖譜。

表3 建模波段對(duì)模型的影響Table 3 The effect of model performance by different regions

3 山茱萸樣品在前處理后的近紅外光譜的二階導(dǎo)數(shù)圖譜Fig.3 The second derivative spectrum of Fructus Corni samples

3.4 建模主成分的選擇

主成分的選擇直接關(guān)系到PLS 定量分析模型的實(shí)際預(yù)測(cè)能力。主因子數(shù)過(guò)少，會(huì)導(dǎo)致建模信息不全;主因子數(shù)過(guò)多會(huì)導(dǎo)致模型過(guò)擬合，這均會(huì)降低模型的預(yù)測(cè)能力。本實(shí)驗(yàn)用交互驗(yàn)證法，考察主因子數(shù)對(duì)RMSECV 的影響，選擇最適主因子數(shù)。根據(jù)校正集RMSECV 與主成分?jǐn)?shù)之間的相關(guān)圖，如圖4所示，當(dāng)RMSECV 值最小為0.2738，所選主成分?jǐn)?shù)最佳為10。

圖4 校正集RMSECV 與主成分?jǐn)?shù)之間的相關(guān)圖Fig.4 Correlation plot of RMSECV values and different principal components

3.5 莫諾苷模型的建立

采用以上確定的最優(yōu)條件，即PLS+SNV+二階導(dǎo)數(shù)法光譜前處理方法，建模范圍4011.21～8000.00 cm-1，選擇10 個(gè)主成分建立最優(yōu)校正模型。所建模型的校正集相關(guān)系數(shù)R2為0.9857，校正均方差RMSEC 為0.105，預(yù)測(cè)均方根偏差為0.234，其結(jié)果如圖5、6 所示。

圖5 校正集預(yù)測(cè)值與參考值之間的相關(guān)圖Fig.5 Correlation between NIR predicted values and reference values

圖6 預(yù)測(cè)絕對(duì)誤差與參考值相關(guān)圖Fig.6 Deviation between NIR predicted values and reference values

3.6 莫諾苷定量模型的驗(yàn)證

將17 份驗(yàn)證集樣品的NIR 圖譜輸入定量分析模型，預(yù)測(cè)其莫諾苷含量，并與高效液相色譜法測(cè)得值進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 NIR 預(yù)測(cè)值與高效液相色譜值的比較Table 4 Comparison of NIR predicted and conference values

由表4 知，最大絕對(duì)偏差0.42%，以驗(yàn)證集樣品的NIR 預(yù)測(cè)值與HPLC 測(cè)定值的比值作為預(yù)測(cè)回收率，所得平均回收率102.36%，結(jié)果表明，利用近紅外光譜技術(shù)測(cè)定山茱萸中莫諾苷的含量是可行的。

3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將17 個(gè)驗(yàn)證集樣品NIR 預(yù)測(cè)值與高效液相色譜法所測(cè)得的分析值進(jìn)行配對(duì)t 檢驗(yàn)，結(jié)果顯示t=-0.591，雙側(cè)P=0.563＞0.05，按α=0.05 水準(zhǔn)不拒絕H0，即說(shuō)明兩種方法的分析結(jié)果差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明該模型可用于預(yù)測(cè)其覆蓋范圍內(nèi)的山茱萸中莫諾苷含量。

4 結(jié)論

在用高效液相色譜法測(cè)量山茱萸中莫諾苷時(shí)，選擇流動(dòng)相的時(shí)候，參考藥典，以乙腈和水為流動(dòng)相，來(lái)摸索其比例過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，乙腈的比例越大，莫諾苷的保留時(shí)間越小，但不能完全分離，從乙腈:水=19∶81 開(kāi)始，逐漸降低乙腈的比例，直到11∶89 才能將其完全分開(kāi)，分離效果較好，因此選擇該比例為最佳流動(dòng)相條件。

中藥材生長(zhǎng)的環(huán)境不同，致使其內(nèi)在成分有所差異，有效成分含量亦不相同，本研究能夠?yàn)橹兴幧杰镙堑馁|(zhì)量控制研究提供一種有效的研究途徑和思路。通過(guò)NIRS 光譜法與化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)相結(jié)合，采用了偏最小二乘法，通過(guò)比較選擇了最佳的近紅外光譜的前處理方法、建模譜段和主因子數(shù)，建立了山茱萸中莫諾苷含量的定量校正模型，模型的預(yù)測(cè)能力較好。結(jié)果表明該方法快速、準(zhǔn)確、無(wú)損、無(wú)污染，為制藥企業(yè)山茱萸藥材中莫諾苷快速分析提供了一種快速和綠色方法。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(國(guó)家藥典委員會(huì)).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中華人民共和國(guó)藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，26.

2 Dai JZ(戴建子)，Zhang ZH(張志豪)，Tang L(唐蕾)，et al.Advance on chemical compositions and pharmacology of Cornus officinalis.China Pharm(中國(guó)藥業(yè))，2006，15(2):74-78.

3 Zhang YE，Liu EH，Li HJ，et al.Chemical constituents from the fruit of Cornus officinalis.Chin J Nat Med(中國(guó)天然藥物)，2009，7:365-370.

4 Cao G，Zhang Y，Cong XD，et al.Research progress on the chemical constituents and pharmacological activities of Fructus Corni.J Chin Pharm Sci，2009，18:208-212.

5 Liu H(劉洪)，Xu HQ(許惠琴).Advance in research of Fructus Corni officinalis and its main compositions.J Nanjing TCM Univ，2003，19:254-257.

6 Zhang ZL(張振凌)，Zhao JY(趙建穎)，Li J(李娟)，et al.Function of getting rid of cores of Cornus officinalis Sieb.Et Zucc.and studies on method of processing in producing area.J Chin Med，2006，29:60-63.

7 Bai Y(白雁)，Li S(李珊)，Wang X(王星)，et al.Determination of chlorogenic acid of honeysuckle by near-infrared spectroscopy rapidly.Chin J Exp Tradit Med Form(中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志)，2011，17(5):66-70.

8 Gong HY(龔海燕)，Song RL(宋瑞麗)，Bai Y(白雁)，et al.The discrimination of Tiegun Yan using NIR combine conformity test.Comp App Chem(計(jì)算機(jī)與應(yīng)用化學(xué))，2010，27:967-970.

9 Li R(李睿)，F(xiàn)an XL(樊夏雷)，Zhou XH(周小華)，et al.Identification of Aristolochia manshuriensis，Clematis armandi and Akebia trifoliate by near infrared diffuse reflectance spectra.Chin J Pharm(中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志)，2011，42:933-937.

10 Bai Y，Zhang W，Xie CX，et al.Fast determination of active components in Scutellaria extract by NIRS combined with PLS.2012 International Conference on Biomedical Engineering and Biotechnology，1034-1038.