不同處理方式對(duì)枸杞多糖抗氧化活性影響的研究

魯曉麗，慕家琪，張自萍

寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021

枸杞子為茄科(Solanaceae)植物寧夏枸杞(Lycium barbarum L.)的干燥成熟果實(shí)。近幾十年來，許多學(xué)者對(duì)枸杞子進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)它在調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、抗腫瘤、降低血脂和血糖等方面表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景［1］。根據(jù)檢索的文獻(xiàn)可見，從中醫(yī)到西醫(yī)，從國內(nèi)到國外，枸杞多糖(Lycium barbarum Polysaccharides，LBP)一直是近年來研究枸杞藥理和保健作用的焦點(diǎn)［2，3］?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，枸杞的藥理作用與其生物活性成分枸杞多糖密切相關(guān)。枸杞多糖是一種非特異性免疫增強(qiáng)劑，具有增強(qiáng)免疫力、抗癌、防衰老、增加造血功能、防止遺傳損傷等作用［4，5］。但是由于枸杞多糖制備過程可能存在原料、種屬、地域、提取處理方法等方面的差異性，也可能是枸杞多糖蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在，所以枸杞多糖的相關(guān)研究重復(fù)性較差，對(duì)其活性的研究造成了一定的障礙。

有機(jī)溶劑洗滌法是枸杞多糖提取研究中普遍使用的一種化學(xué)脫水和脫色的方法［6］。冷凍干燥是使食品在低壓、低溫下進(jìn)行水分蒸發(fā)，利用冰的升華原理，在高真空的環(huán)境條件下，將凍結(jié)食品中的水分不經(jīng)過冰的融化直接從固態(tài)冰升華為水蒸氣而使物料干燥。與其他脫水技術(shù)相比，冷凍干燥技術(shù)是能夠保持食品物料營養(yǎng)成分最好的方法［7］。大孔吸附樹脂脫色，通過物理吸附從水溶液中有選擇性的吸附有機(jī)物。大孔吸附樹脂有一定的選擇性、強(qiáng)度好、產(chǎn)品純度高、重復(fù)使用等特點(diǎn)［8］，并且已成功地應(yīng)用于工業(yè)脫色。

目前，關(guān)于枸杞多糖的處理方式和其生物活性的研究數(shù)不勝數(shù)，但是關(guān)于處理方式對(duì)其生物活性影響的研究少見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過DPPH 法和Fenton 法測(cè)定枸杞多糖對(duì)DPPH 自由基和羥自由基的清除率，研究有機(jī)溶劑洗滌法、冷凍干燥法、大孔吸附樹脂脫色法三種處理方式對(duì)所得枸杞多糖生物活性的影響。以期為枸杞多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和有價(jià)值的參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;SHB-III 循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;回流提取裝置;微型植物試樣粉碎機(jī)，長沙步源制藥機(jī)械設(shè)備有限公司;U-5100 比例光束分光光度計(jì)，日立高新技術(shù)公司。

1.2 材料與試劑

枸杞，購自寧夏中寧;Vc 對(duì)照品，天津傲然精細(xì)化工研究所;DPPH、磷酸緩沖液(pH 7.4)、鄰菲羅啉、硫酸亞鐵、H2O2、硫酸、苯酚、石油醚、乙醇、丙酮等均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品的前處理

將干燥的枸杞子，采用微型植物試樣粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過40 目篩，得到枸杞粉末，備用。

2.2 供試品溶液的制備

［9］報(bào)道方法并稍作改進(jìn)。稱取枸杞粉末0.05 kg，置普通回流裝置中，加入石油醚0.5 L，60 ℃回流脫脂3 次，每次1 h。濾出溶劑，殘?jiān)L(fēng)干后加入80%乙醇0.5 L，60 ℃回流3 次，每次1h，回收乙醇。再70 ℃水提3 次，每次2 h，料液比1:10，合并水提濾液濃縮，以4 倍體積的95%乙醇沉淀，過夜，離心得沉淀物，以備采用不同處理方式進(jìn)一步處理。

2.3 有機(jī)溶劑洗滌法

將2.2 所得沉淀物先后用95%乙醇、無水乙醇、丙酮洗滌數(shù)分鐘，傾倒上清液，置于通風(fēng)櫥內(nèi)揮干試劑［7］，得到固形物樣品Ⅰ。

2.4 冷凍干燥法

將2.2 得到的沉淀用水復(fù)溶，置于冷凍干燥機(jī)干燥［9］，得到樣品Ⅱ。

2.5 大孔樹脂脫色法

將2.2 所得沉淀物用水復(fù)溶，經(jīng)D318 大孔吸附樹脂處理(相關(guān)實(shí)驗(yàn)另投它稿)，得到樣品Ⅲ。

2.6 抗氧化活性的測(cè)定

2.6.1 清除DPPH 自由基能力的測(cè)定

在文獻(xiàn)［10］報(bào)道的基礎(chǔ)上稍作改進(jìn)，稱取4 mg DPPH 至250 mL 容量瓶中，用極少量的乙醇溶解，然后加入50%乙醇定容至刻度。分別取不同濃度的樣品溶液2 mL，加入2 mL DPPH 溶液，室溫反應(yīng)30 min，至525 nm 波長處測(cè)得吸光度，為Ai。根據(jù)以下公式求得DPPH 自由基清除率。

式中，Ac:未加樣品的DPPH 溶液;Aj:空白吸光度;Ai:樣品溶液的吸光度。

2.6.2 清除羥自由基能力的測(cè)定

在文獻(xiàn)［10，11］報(bào)道的基礎(chǔ)上稍作改進(jìn)，在試管中分別加入2 mL pH7.4 的磷酸鹽緩沖液，0.3 mL 2.5 mmol/L 鄰菲羅啉溶液，充分混勻后，加入0.2 mL 7.5 mmol/L FeSO4溶液，每加一管立即搖勻。然后向其中加入提取溶液，混勻，再加入1 mL 0.1%H2O2，最后補(bǔ)充體積至8 mL。另再做損傷管和未損傷管，其中損傷管中加入0.1% H2O2，未損傷管不加H2O2，最后補(bǔ)充各管體積至8 mL，于37 ℃下保溫1 h，在510 nm 波長處測(cè)吸光度計(jì)算清除率:

其中，A0:未損傷管的吸光度;A1:損傷管的吸光度;A2:樣品液的吸光度。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同處理方式對(duì)枸杞多糖清除DPPH 自由基能力的影響

二苯代苦味?；杂苫?DPPH·)是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若受試物能將其清除，則表明受試物具有降低羥自由基、烷基自由基或過氧化自由基或打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用。通過測(cè)定清除DPPH 自由基的方法表征枸杞多糖清除自由基的活性。如圖1 所示，不同處理方式得到枸杞多糖對(duì)DPPH 自由基的清除效果。

由圖1 顯示可知，枸杞多糖有顯著的清除DPPH 自由基能力，且表現(xiàn)出良好的劑量依賴關(guān)系，在質(zhì)量濃度為0.5～2.5 mg/mL 時(shí)，枸杞多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力低于Vc，但隨著質(zhì)量濃度的升高其清除能力增強(qiáng)，不斷的接近于Vc。以Vc 為對(duì)照，不同處理方式得到的枸杞多糖對(duì)DPPH 自由基的清除能力是不同的，并且存在極顯著差異(P＜0.01)。清除能力大小順序:樣品Ⅲ＞樣品Ⅱ＞樣品Ⅰ。其中2 mg/mL 樣品Ⅲ清除能力最高，達(dá)62.46%。

枸杞多糖對(duì)DPPH 自由基清除能力可能是由于多糖中的羥基具有供氫質(zhì)體能力。樣品1 在有機(jī)溶劑洗滌過程中，有機(jī)溶劑對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)有一定程度的破壞，可能會(huì)導(dǎo)致其清除DPPH·的能力有所下降;冷凍干燥處理得到的樣品Ⅱ，主要以枸杞多糖與色素復(fù)合物的形式存在，結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，導(dǎo)致其對(duì)DPPH 自由基的清除能力減弱;經(jīng)過大孔吸附樹脂處理后得到的樣品Ⅲ，可以去除一些色素、蛋白以及鹽分子，大部分以游離的多糖分子存在，與DPPH 自由基結(jié)合，清除能力增強(qiáng)，抗氧化能力升高。

3.2 不同處理方式對(duì)枸杞多糖清除羥基自由基能力的影響

不同處理方式得到枸杞多糖對(duì)羥自由基的清除效果如圖2。

羥自由基是自由基當(dāng)中化學(xué)性質(zhì)最活潑、毒性最大的一種。如圖2 所示:多糖樣品的清除能力隨濃度的增大而增大，一定范圍內(nèi)成量效關(guān)系。低濃度枸杞多糖對(duì)羥自由基的清除能力大于Vc，隨著濃度的不斷增加，其清除能力逐漸低于Vc。并且枸杞多糖的處理方式不同，其清除能力不同。在質(zhì)量濃度為1 mg/mL 時(shí)，以Vc 為對(duì)照，樣品Ⅱ及樣品Ⅲ對(duì)羥基的清除能力存在顯著差異(P＜0.05);其中，樣品Ⅰ清除羥自由基能力不顯著(P＞0.05);樣品Ⅱ?qū)αu自由基的清除能力達(dá)到92.02%，略高于樣品Ⅰ和樣品Ⅲ，并且樣品Ⅰ和樣品Ⅲ的清除羥自由基的能力相當(dāng)?？赡茉蚓褪怯袡C(jī)溶劑使得樣品Ⅰ中一些糖蛋白變性，枸杞多糖的構(gòu)象有一定程度的損壞并且其中枸杞多糖的含量較低;樣品Ⅱ盡可能的保存了所有營養(yǎng)物質(zhì)(枸杞多糖、色素、糖蛋白等)，它們對(duì)羥自由基都有不同程度的清除作用;樣品Ⅲ經(jīng)過大孔吸附樹脂的初步分離純化，其枸杞多糖純度較其他兩種都高，但其清除羥自由基能力低于樣品Ⅱ，說明并不是枸杞多糖純度越高，對(duì)羥自由基清除作用就越大。

4 討論

由實(shí)驗(yàn)可以得出不同方式處理的枸杞多糖對(duì)DPPH 自由基和羥基自由基均有不同程度的清除能力，且表現(xiàn)出良好的劑量依賴關(guān)系。

有機(jī)溶劑洗滌法不僅對(duì)枸杞多糖的分子構(gòu)象有一定的損害，導(dǎo)致其含量以及清除DPPH 和羥自由基的能力不高;而且有機(jī)溶劑具有揮發(fā)性，可以引起實(shí)驗(yàn)員中樞神經(jīng)畸形或慢性中毒。所以在多糖抗氧化活性以及其他生物活性的研究中不建議使用此方法。

冷凍干燥法作為物理方法，能夠保持食品物料營養(yǎng)成分最好的方法。能較好地保持食品原來的形狀，減少食品色、香、味及營養(yǎng)成分的損失，減少了食品中脂質(zhì)的氧化，凍干制品中蒸發(fā)掉的水分空間還存在，因而具有多孔結(jié)構(gòu)，速溶性和快速復(fù)水性很好，在升華過程中溶于水的可溶性物質(zhì)就地析出，溶于水的無機(jī)鹽還均勻地存在，避免了一般干燥方法中因物料內(nèi)部水分向表面遷移而營養(yǎng)損失等現(xiàn)象。冷凍干燥法比較溫和，保證了枸杞多糖構(gòu)象的完整性，但是影響了枸杞多糖的純度。但是對(duì)自由基清除作用的有效成分不明確，有待進(jìn)一步研究。

大孔吸附樹脂是一類不含交換基團(tuán)且有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附樹脂，是植物多糖分離純化的一種有效方法。將游離的色素類化合物和蛋白質(zhì)吸附，起到一種初步純化的作用。同時(shí)其過程中避免不了的是會(huì)有少量枸杞多糖被吸附。但是最終對(duì)DPPH自由基的清除能力較其他兩種方法的都高。對(duì)羥自由基的清除作用居中，說明并不是枸杞多糖純度越高，對(duì)羥自由基清除作用就越大。

由此可見，不同處理方式影響了枸杞多糖的生物活性。研究者可以按自己的實(shí)驗(yàn)要求選擇合適的處理方式，避免處理方式不當(dāng)，影響枸杞多糖的生物活性。

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