斑蝥素酸鎂對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721裸鼠皮下移植瘤凋亡的影響

晏 容，劉 云，朱欣婷，易小飛，劉 流，張?jiān)戚x，李曉飛*

1 遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;2 遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，遵義 563003;3 貴州柏強(qiáng)制藥有限公司，貴陽(yáng) 550001

斑蝥素是一種來(lái)源于抗癌昆蟲——斑蝥的抗腫瘤活性物質(zhì)，對(duì)原發(fā)性肝癌、腹水型肝癌等具有良好治療效果［1］，但由于其水溶性差，造成在使用上的諸多不便。目前，國(guó)內(nèi)已有研究者制備出水溶性較好的斑蝥酸鈉，并將其開發(fā)為注射液廣泛應(yīng)用于臨床治療(如:貴州柏強(qiáng)制藥有限公司開發(fā)的《斑蝥酸鈉維生素B6 注射液》)。本課題組在此基礎(chǔ)上，以斑蝥素為原料研制出一種水溶性和體外抗癌活性都較好的斑蝥素鹽類衍生物——斑蝥素酸鎂［2，3］。為了進(jìn)一步明確該化合物的體內(nèi)抗癌活性，課題組構(gòu)建了人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 裸鼠皮下移植瘤模型，并對(duì)斑蝥素酸鎂的體內(nèi)抑癌機(jī)制進(jìn)行了初步研究，以期為下一步開發(fā)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 藥物

斑蝥素酸鎂由自制斑蝥素合成而來(lái)，已授權(quán)國(guó)家發(fā)明專利［4］。

1.1.2 肝癌細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/C 裸鼠，4 周齡，體重15～17 g，雄性，購(gòu)于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào):SCXK(京)2009-0004;在遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)條件下飼養(yǎng)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室合格證號(hào):SYXK(黔)2011-003。

1.1.4 試劑

RPMI-1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO 公司;南美胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)HYCLONE 公司;鼠抗人AFP 單克隆抗體、SP 免疫組化試劑盒、PV6001 二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒及鼠抗人bcl-2、bax 單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.5 儀器

3131 型CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo 公司;超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司;倒置顯微鏡，日本Nikon 公司;NikonYS100 光學(xué)顯微鏡，日本Nikon 公司;H-7550 型透射電鏡，日本Hitachi 公司;JEM-1400 型透射電鏡，日本電子公司;細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)，德國(guó)Leica 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 采用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 裸鼠皮下移植瘤模型的建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，PBS洗兩次，用0.25%胰酶消化，1000 rpm 離心5 min，收集細(xì)胞，鏡下計(jì)數(shù)。生理鹽水調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/mL，每只取0.2 mL 接種于裸鼠腋窩皮下，接種后每日觀察裸鼠成瘤情況。隨機(jī)挑取已成瘤的裸鼠三只，頸椎脫位法處死裸鼠，取移植瘤標(biāo)本。置于10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE 染色后用光鏡觀察移植瘤組織病理學(xué)變化。同時(shí)按照SP 試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化染色。陰性對(duì)照用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。AFP 染色的陽(yáng)性判斷:腫瘤細(xì)胞胞漿出現(xiàn)黃色或棕黃色物質(zhì)。最后結(jié)合移植瘤組織病理學(xué)變化和AFP 染色結(jié)果確定人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型是否成功建立。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為兩組，分別為生理鹽水組(n=5)、斑蝥素酸鎂組(n=5)。待移植瘤體積大小約150～250 mm3開始用藥，以每只裸鼠6.26×10-5mmol 劑量的斑蝥素酸鎂進(jìn)行瘤周注射，對(duì)照組給予相同容積的無(wú)菌生理鹽水瘤周注射，注射隔日一次，共計(jì)11 次;22 d 后，觀察裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)情況，并取出實(shí)體瘤作后續(xù)研究。

1.2.4 人肝癌裸鼠皮下移植瘤組織形態(tài)特征的觀察

取斑蝥素酸鎂組、生理鹽水組移植瘤標(biāo)本，置于10%福爾馬林中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE 染色，光鏡下觀察移植瘤的組織形態(tài)特征。

1.2.5 透射電鏡觀察人肝癌裸鼠皮下移植瘤組織超微結(jié)構(gòu)

移植瘤標(biāo)本置于3.5%戊二醛進(jìn)行前固定;PBS沖洗后用1%鋨酸后固定2 h;常規(guī)梯度丙酮脫水;梯度Epon812 包埋劑浸透，純包埋劑包埋并聚合;超薄切片;染色;透射電子顯微鏡下觀察。

1.2.6 免疫組化法檢測(cè)人肝癌裸鼠皮下移植瘤組織中bcl-2、bax 的表達(dá)

將瘤體于10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。按照PV6001 二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行操作。陰性對(duì)照用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。將切片置于光鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜染成棕黃色或棕褐色的即為bcl-2、bax 陽(yáng)性細(xì)胞。采用Image-Pro Plus 圖像分析軟件對(duì)bcl-2、bax 的表達(dá)進(jìn)行定量分析(每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)高倍鏡視野，測(cè)量每個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值)。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用SPSS 13.0 軟件包進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05 表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 裸鼠皮下移植瘤模型的建立

裸鼠皮下移植瘤模型是常用的一種腫瘤實(shí)驗(yàn)研究模型，具有方法簡(jiǎn)便、成瘤率高、易于觀察、測(cè)量等優(yōu)點(diǎn)［5］，因而在腫瘤研究中得了廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)將人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 接種于裸鼠皮下以觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示:平均8～10 d 裸鼠腋窩皮下接種處出現(xiàn)瘤塊，成瘤率100%，隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，瘤塊逐漸增大(圖1)，無(wú)自發(fā)消退現(xiàn)象。HE 染色，在光學(xué)顯微鏡下可見，腫瘤細(xì)胞呈大小不等實(shí)性、巢團(tuán)狀分布，未見明確壞死灶，間質(zhì)纖維組織增生、玻變(圖2)。AFP 染色呈陽(yáng)性即腫瘤細(xì)胞胞漿可見棕黃色物質(zhì)(圖3)。HE 染色、AFP 染色證實(shí)為肝細(xì)胞性肝癌組織，表明裸鼠皮下移植瘤模型建立成功。

圖1 裸鼠成瘤Fig.1 Tumor formation in nude mice

圖2 移植瘤組織HE 染色(×100)Fig.2 HE staining of transplantation tumor tissue(×100)

圖3 移植瘤組織AFP 染色(×400)Fig.3 AFP staining of transplantation tumor tissue(×400)

2.2 斑蝥素酸鎂對(duì)人肝癌裸鼠皮下移植瘤增殖和組織形態(tài)的影響

圖4 斑蝥素酸鎂對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 裸鼠皮下移植瘤增殖的影響Fig.4 The effects of magnesium cantharidate on the proliferation of subcutaneous transplantation tumor from human hepatoma cells SMMC-7721 in nude mice

圖5 斑蝥素酸鎂對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 裸鼠皮下移植瘤組織形態(tài)的影響(HE 染色×400)Fig.5 The effects of magnesium cantharidate on the histomorphology of subcutaneous transplantation tumor from human hepatoma cells SMMC-7721 in nude mice(HE staining×400)

斑蝥素酸鎂處理22 d 后，與生理鹽水對(duì)照組比較，斑蝥素酸鎂處理組皮下移植瘤的體積明顯小于對(duì)照組(圖4)，可見斑蝥素酸鎂對(duì)皮下移植瘤增殖有較強(qiáng)的抑制作用。在此基礎(chǔ)上，可以利用組織形態(tài)學(xué)方法進(jìn)一步檢測(cè)其細(xì)胞凋亡情況。從圖5A 中可以看出，生理鹽水組:裸鼠移植瘤細(xì)胞排列呈條索狀、厚度約3～8 層，條索間可見裂隙狀血竇，腫瘤細(xì)胞呈圓形、多邊形，胞漿豐富、紅染，細(xì)胞核大、深染，可見病理性核分裂。斑蝥素酸鎂組:癌細(xì)胞胞漿固縮、嗜酸性變。細(xì)胞核固縮、碎裂(圖5B)。

2.3 斑蝥素酸鎂對(duì)人肝癌裸鼠皮下移植瘤組織超微結(jié)構(gòu)的影響

在HE 染色法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步結(jié)合透射電鏡進(jìn)行觀察，透射電鏡是最經(jīng)典可靠的判定細(xì)胞凋亡的方法，被認(rèn)為是鑒定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。鏡下見生理鹽水組移植瘤細(xì)胞表面有細(xì)小突起，核質(zhì)比正常，核膜核仁清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體清晰可見(圖6A)。斑蝥素酸鎂組移植瘤細(xì)胞核膜基本消失，染色質(zhì)聚集成團(tuán)，細(xì)胞質(zhì)均質(zhì)，細(xì)胞器基本消失(圖6B)。形態(tài)學(xué)檢測(cè)表明斑蝥素酸鎂在裸鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

圖6 斑蝥素酸鎂對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 裸鼠皮下移植瘤組織超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 The effects of magnesium cantharidate on the ultrastructure of subcutaneous transplantation tumor from human hepatoma cells SMMC-7721 in nude mice

2.4 斑蝥素酸鎂對(duì)人肝癌裸鼠皮下移植瘤組織中bcl-2、bax 表達(dá)的影響

2.4.1 染色觀察

光鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜染成棕黃色或棕褐色的即為bcl-2、bax 陽(yáng)性細(xì)胞。從圖7A、7B 可見，斑蝥素酸鎂組瘤組織中bcl-2 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與著色強(qiáng)度低于生理鹽水組。從圖7C、圖7D 可見，斑蝥素酸鎂組瘤組織中bax 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與著色強(qiáng)度高于生理鹽水組。

2.4.2 圖像分析平均光密度值測(cè)定

斑蝥素酸鎂組瘤組織中bcl-2 陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值(0.172±0.024)，顯著低于生理鹽水組(0.318±0.063)(P＜0.05)。斑蝥素酸鎂組瘤組織中bax 陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值(0.483±0.124)，顯著高于生理鹽水組(0.219±0.071)(P＜0.05)。

圖7 斑蝥素酸鎂作用后人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 裸鼠皮下移植瘤組織中bcl-2、bax 的表達(dá)(×400)Fig.7 The expressions level of bcl-2，bax of subcutaneous transplantation tumor from human hepatoma cells SMMC-7721 in nude mice treated by magnesium cantharidate(×400)

研究表明，細(xì)胞凋亡受細(xì)胞內(nèi)多種基因調(diào)控［6］。其中，bcl-2 和bax 基因均屬于bcl-2 家族中的重要成員。bcl-2 基因是目前公認(rèn)的重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控基因，Schindler 等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)bcl-2 基因可以通過抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［7］。而bax 是目前研究最深入的促凋亡基因之一，其編碼的Bax 蛋白能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡［6］。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè)人肝癌裸鼠皮下移植瘤組織中bcl-2、bax 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示斑蝥素酸鎂組瘤組織中bcl-2 的表達(dá)低于生理鹽水組，而bax 的表達(dá)高于生理鹽水組。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)瘤體積大小、HE 染色組織形態(tài)學(xué)、透射電鏡、bax 和bcl-2 凋亡相關(guān)蛋白一系列指標(biāo)的比較研究，初步探討了斑蝥素酸鎂的體內(nèi)抗癌機(jī)制。研究結(jié)果顯示斑蝥素酸鎂能明顯抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤的增殖;并能誘導(dǎo)移植瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)bax 和下調(diào)bcl-2 表達(dá)有關(guān)。

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