青海干旱生境土壤鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物的分離鑒定及活性研究

余志銀，喻明明，羅劍英，蘇 燦，薛泉宏，黃勝雄，孫 蕓，馬亞團，*

1 新疆醫(yī)科大學中藥系，烏魯木齊 830011;2 中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室，昆明 650201;3 西北農(nóng)林科技大學理學院，楊凌 712100

鏈霉菌是一類高G+C 含量的革蘭氏陽性放線菌，廣泛分布于土壤、海洋、極端環(huán)境及一些生物體內(nèi)［1］。鏈霉菌代謝途徑復雜，能夠產(chǎn)生許多結構新穎的次級代謝產(chǎn)物，在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、食品、化工、環(huán)保等領域具有重要應用價值，是新天然活性物質(zhì)的重要源泉。如最著名的生物農(nóng)藥阿維菌素(Avermectins，簡稱Avm)，由美國Merek 公司于1976 年在日本Kitasato 研究所提供的Streptomyces avermitilis 發(fā)酵物中發(fā)現(xiàn)。其作為一種高效廣譜驅(qū)蟲劑，不僅對線蟲而且對蜱螨類(Acarina)、甲蟲類(Coleoptera)、磷翅目(Lepidoptera)、直翅目(Orthoptera)、雙翅目(Diptera)和膜翅目(Hymenoptera)害蟲均有殺滅作用。其它從鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)的生物農(nóng)藥還有井岡霉素、春雷霉素、農(nóng)抗120、中生菌素等［2］。然而這些生物農(nóng)藥的廣泛使用導致嚴重的藥物抗性問題，故尋找新的潛在的生物農(nóng)藥就顯得至關重要。

番茄作為一種世界性蔬菜作物，其病害番茄灰霉病、番茄早疫病已成為影響番茄種植和品質(zhì)的主要因素［3-5］。為了尋找新的抗植物病原菌天然活性物質(zhì)，本課題組對多株鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物進行了活性篩選，得到一株具有較好抑菌活性的鏈霉菌KIBHL8。因此，我們擴大了該菌株的發(fā)酵規(guī)模，對發(fā)酵液中的次級代謝產(chǎn)物進行提取分離，得到了5 個化合物，結構分別鑒定為:N-乙酰酪胺(1)、N-乙酰色胺(2)、吡咯-2-甲酰胺(3)、Inthomycin C(4)和Inthomycin B(5)(見圖1)，并對其抗真菌和抗細菌活性進行篩選，旨在確定其中的抗菌活性成分。

圖1 化合物1～5 的化學結構Fig.1 Chemical structures of compounds 1-5

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker DRX-500、Avance Ⅲ-600 核磁共振儀(TMS 作為內(nèi)標，δ 為ppm)，Waters Xevo TQ-S 型超高壓液相三重四極桿聯(lián)用質(zhì)譜儀;ZQZY-HC 恒溫搖床(上海知楚儀器)，薄層色譜硅膠板和200-300 目柱色譜硅膠(青島海洋化工廠)，Sephadex LH-20(瑞典AIRTECH 生物化學試劑公司生產(chǎn))，Hitachi Chromaster 5430 高效液相色譜儀(日立)，YMC-Triat C18型液相色譜柱(250×10 mm I.D.)，中速濾紙(杭州新華紙業(yè)有限公司)，YXQ-LS-18SI 高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)。其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑(天津市大茂化學試劑廠，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。

1.2 發(fā)酵菌株

發(fā)酵菌株Streptomyces pactum KIB-HL8 由西北農(nóng)林科技大學資源環(huán)境學院微生物資源研究室薛泉宏教授課題組提供，菌株分離自青海干旱土壤樣本(海西蒙古族藏族自治州德令哈市，東經(jīng)93°06＇40.6″～96°22＇14.9″，北緯35°57＇54.2″～ 37°15＇09.8″)。通過對其16S RNA 進行基因測序，發(fā)現(xiàn)其序列與Streptomyces pactum AB184398，Streptomyces olivaceus AB249920 的序列相似度分別是99.4% 和99.3%，故將其初步鑒定為密旋鏈霉菌(S.pactum)。菌株KIB-HL8 保藏于昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室。

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

固體培養(yǎng)基:為MS 培養(yǎng)基，配方為大豆粉20.0 g/L(煮沸過濾取濾液)，甘露醇20.0 g/L，技術瓊脂粉20.0 g/L，pH=7.0。

種子培養(yǎng)基:為TSB 培養(yǎng)基，配方為胰蛋白胨17.0 g/L，大豆蛋白胨3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，磷酸氫二鉀2.5 g/L，右旋葡萄糖2.5 g/L，pH=7.3±0.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基:胰蛋白胨2.0 g/L，葡萄糖5.0 g/L，可溶性淀粉12.0 g/L，玉米漿7.0 g/L，酵母提取物2.0 g/L，CaCO32.0 g/L，NaCl 4.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO41.0 mg/L，MnCl21.0 mg/L，ZnSO41.0 mg/L，pH=7.5-7.8。

PDA:200.0 g 去皮土豆切碎，加入1.0 L 水，煮沸30 min，用四層紗布過濾除，濾液定容到1.0 L，加20.0 g 瓊脂粉，加熱攪拌使其溶解，再加20.0 g 葡萄糖。

LB:胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，技術瓊脂粉20.0 g/L，pH=7.4。

將在MS 平板上活化好的菌株接種到20 只裝有50 mL 種子液的250 mL 三角瓶中，置于28 ℃，220 rpm 搖床上培養(yǎng)2 d。

將種子液按10%接種量轉接到60 只盛有250 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的1 L 三角瓶中，置于28 ℃，220 rpm 搖床上培養(yǎng)7 d。

1.4 提取與分離

將發(fā)酵液于6000 rpm 轉速下離心20 min。上清液用等體積的乙酸乙酯萃取3 次，用無水硫酸鈉干燥，有機相減壓濃縮后得1.5 g 粗提物。經(jīng)硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(10∶0、10∶1、10∶2、0∶10)，得到四個組分(Frs.A-D)。Frs.B 段過凝膠色譜Sephadex LH-20，甲醇洗脫，TLC 分析，得到3 個組分(Frs.B 1-3)。用HPLC 分析后，F(xiàn)rs.B-2段用高效液相色譜制備，用28%～100%甲醇-水梯度洗脫，富集20.2 min 的流份得化合物1(57 mg)，富集37.1 min 的流份得化合物4(1.4 mg)，富集41.3 min 的流份得化合物5(1.0 mg);Frs.B-3 段用高效液相色譜制備，以50%的甲醇-水等度洗脫，富集12.5 min 的流份得化合物2(6.2 mg)。Frs.C段經(jīng)過Sephadex LH-20(甲醇洗脫)后，TLC 分析，得到3 個組分(Frs.C 1-3)，用HPLC 分析后，F(xiàn)rs.C-2段用HPLC 制備，以15%的甲醇-水等度洗脫，富集16.5 min 的流份得化合物3(14 mg)。

1.5 活性測試(濾紙片法)

將保存于石蠟油中的測試菌株番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、小麥赤霉病菌(Gibberella saubinetti)、蘋果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporiodes)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.Vasinfectum)、馬鈴薯干腐病菌(Fusarium solani)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、蘋果腐爛病(Valsa mali Miyabe et Yamada)分別接種至PDA 培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，28 ℃避光培養(yǎng)4 d，待其菌落基本長滿培養(yǎng)皿為止即可用。將保存于甘油中的測試菌株金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)接種至LB 培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，28 ℃避光培養(yǎng)12 h，待其菌落基本長滿培養(yǎng)皿為止即可用。

化合物1、2、3、4、5 和卡那霉素均配制成濃度為2.0 mg/mL 的丙酮溶液備用。

取無菌濾紙片(用打孔器將濾紙片加工成直徑為5 mm)，滴上10 μL 樣品溶液，待溶劑揮干后移入已接菌的培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)皿中心到濾紙片中心的距離約為30 mm 左右，金黃色葡萄球菌放在37℃培養(yǎng)12 h，其他菌株放在28 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察抑菌圈大小，用十字交叉法測量抑菌圈直徑。以空白對照長至濾紙片為依據(jù)，測量菌落邊緣到濾紙片的距離。測試時以無菌水和丙酮為陰性對照，以卡那霉素為陽性對照，每塊平板中都需有陽性對照［6］。重復平行做3 次，抑菌圈直徑測量3 次求平均值。

2 結果與分析

2.1 化合物結構鑒定

化合物1 無色粉末;分子式C10H13NO2;ESIMS m/z:180［M+H］+;1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ:7.00(2H，d，J=8.5 Hz，H-2，6)，6.72(2H，d，J=8.5 Hz，H-3，H-5)，3.31(2H，t，J=7.5 Hz，H-7)，2.66(2H，t，J=7.5 Hz，H-8)，1.88(3H，s，CH3);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ:22.6(CH3)，35.7(C-8)，42.6(C-7)，116.3(C-3，C-5)，130.8(C-2，C-6)，131.3(C-1)，156.9(C-4)，173.25。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致［7］，故鑒定為N-乙酰酪胺。

化合物2 淺褐色油狀物;分子式C12H14N2O;ESI-MS m/z:225［M+Na］+，［M+H］+203;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:7.55(1H，d，J=7.8 Hz，H-4)，7.32(1H，d，J=7.8 Hz，H-7)，7.08(1H，d，J=7.8 Hz，H-6)，7.06(1H，m，H-5)，7.00(1H，m，H-2)，3.46(2H，t，J=7.2 Hz，H-9)，2.93(2H，t，J=7.2 Hz，H-8)，1.91(3H，s，CH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:173.4(C-1＇)，138.3(C-7a)，128.9(C-3a)，123.5(C-2)，122.4(C-6)，119.7(C-5)，119.4(C-4)，113.4(C-3)，112.4(C-7)，41.7(C-9)，26.4(C-8)，22.7(CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致［8］，故鑒定為N-乙酰色胺。

化合物3 白色粉末;分子式C5H6N2O;ESI-MS m/z:111［M+H］+;1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ:6.91(1H，dd，J=2.5，1.5 Hz，H-5)，6.80(1H，dd，J=3.5，1.5 Hz，H-3)，6.15(1H，dd，J=3.5，2.5 Hz，H-4);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ:165.9 C-6)，126.4(C-2)，123.3(C-5)，112.9(C-3)，110.3(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致［9］，故鑒定為吡咯-2-甲酰胺。

化合物4 黃色油狀物;分子式C16H22N2O3;ESI-MS m/z:291［M+H］+;1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:7.79(1H，s，H-13)，6.80(1H，s，H-12)，6.39(1H，dd，J=11.4，14.2 Hz，H-6)，6.23～6.18(3H，m，H-8，H-7，NH)，6.02(1H，d，J=11.4 Hz，H-5)，5.76(1H，m，H-9)，5.44(1H，brs，NH)，4.0(1H，brs，H-3)，3.80(1H，brs，OH)，3.49(2H，d，J=4.8 Hz，H-10)，1.79(3H，s，4-CH3)，1.30(3H，s，2-CH3)，1.11(3H，s，2-CH3);13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:180.6(C-1)，150.8(C-11)，150.4(C-13)，137.9(C-4)，133.4(C-8)，132.4(C-7)，128.8(C-5)，128.0(C-6)，127.4(C-9)，122.5(C-12)，83.8(C-3)，44.9(C-2)，28.9(C-10)，25.7(2-CH3)，21.7(2-CH3)，13.3(4-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致［10］，故鑒定為Inthomycin C。

化合物5 黃色油狀物;分子式C16H22N2O3;ESI-MS m/z:291［M+H］+;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:8.09(1H，s，H-13)，6.85(1H，s，H-12)，6.56(1H，dd，J=13.8，11.4 Hz，H-6)，6.26(1H，dd，J=15.0，10.8 Hz，H-8)，6.16(1H，dd，J=13.8，10.8 Hz，H-7)，6.01(1H，d，J=11.4 Hz，H-5)，5.76(1H，dt，J=15.0，7.2 Hz H-9)，4.68(1H，s，H-3)，3.51(2H，d，J=7.2 Hz，H-10)，1.79(3H，s，4-CH3)，1.25(3H，s，2-CH3)，1.05(3H，s，2-CH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:183.4(C-1)，153.1(C-13)，152.8(C-11)，139.3(C-4)，134.8(C-8)，132.9(C-7)，130.9(C-5)，129.2(C-6)，128.2(C-9)，122.7(C-12)，75.9(C-3)，46.7(C-2)，29.4(C-10)，26.3(2-CH3)，21.9(2-CH3)，19.8(4-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致［11］，故鑒定為Inthomycin B。

2.2 化合物抑菌活性結果

通過對10 株病原菌株的測試，發(fā)現(xiàn)化合物4 對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)有抑制活性，對其他所測試病原菌沒有活性;化合物1 和2 對番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)有抑制活性，對其他所測試病原菌沒有活性;化合物3 對番茄早疫病菌(Alternaria solani)有較強的抑制活性，對其他所測試病原菌沒有活性;化合物5 對所測試病原菌均無活性(見表1)。

表1 化合物1～5 抑菌圈直徑(mm)Table 1 The diameter of inhibition zone of compounds 1-5(mm)

3 討論

本研究從鏈霉菌Streptomyces pactum KIB-HL8發(fā)酵液中分離得到5 個化合物，其中化合物1 由Sobolevskaya 等人報道具有細胞毒活性，可以抑制海膽胚胎細胞的增值［12］?；衔? 由張文娟等人報道對革蘭氏陽性菌有較強的抑制作用如蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)，枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)，對革蘭氏陰性菌無明顯活性［13］。另外Inthomycin 類化合物是一種惡唑三烯類抗生素，Uemura等人在1985 年首次報道了惡唑霉素A 和新的惡唑霉素，這類抗生素具有廣譜、有效的抗菌、抗病毒，抗腫瘤活性［10］。1990 年ōmura 等人從鏈霉菌中首次分到Inthomycin A 和異構體Inthomycin B、Inthomycin C。這類化合物是一種高度特異性纖維素生物合成抑制劑，并具有很強的抗菌活性和除草活性［10］。中國是番茄出口大國，番茄種植面積約145.5 萬hm2，保護地栽培面積已達21.7 萬hm2，年產(chǎn)量約837.6 萬噸且以每年6%～8%的速度增長，與此同時番茄上的各種病害也在逐年增加［14］。本實驗首次發(fā)現(xiàn)化合物1 和2 對番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)有抑制活性，化合物3 對番茄早疫病菌(Alternaria solani)有較強的抑制活性，這為開發(fā)新型抑制番茄病害的生物農(nóng)藥提供理論和數(shù)據(jù)指導。

1 Dai FP(代芳平)，Li SW(李師翁).Progress on the secondary metabolites and applications of Streptomyces.Biotech Bull(生物技術通報)，2014，3(4):30-35.

2 Jiang L(蔣琳)，Ma CZ(馬承鑄).Research advance biological pesticides.Acat Agric Shanghai(上海農(nóng)業(yè)學報)，2000，16:73-77.

3 Xu YH(徐艷輝)，Li Y(李燁)，Xu XY(許向陽).Research progress of tomato Fusarium wilt.J Northeast Agric Univ(東北農(nóng)業(yè)大學學報)，2008，39:128-134.

4 Wang ST(王樹桐)，Hu TL(胡同樂)，Wang XY(王曉燕)，et al.Screening of plant extracts for the fungi toxicity against Botrytis cinerea.J Agric Univ Hebei(河北農(nóng)業(yè)大學學報)，2003，26:61-64.

5 Wu RF(吳仁鋒)，Wang ZH(汪志紅).Preliminary review on Alternaria solani of tomato.Chin Plant Protect(中國植保導刊)，2009，3:16-18.

6 Fang ZD(方中達).Research Methods on Plant Diseases.Beijing:China Agriculture Press(中國農(nóng)業(yè)出版社)，1979.

7 Zhao PJ，Wang HX，Li GH，et al.Secondary metabolites from endophytic Streptomyces sp.Lz531.Chem Biodivers，2007，4:899-904.

8 Maeda U，Hara N，F(xiàn)ujimoto Y，et al.N-fatty acyl tryptamines from annona reticulata.Phytochem，1993，34:1633-1635.

9 Konig GM，Wfught AD.Two new naturally occurring pyrrole derivatives from the tropical marine sponge Agelas oroides.Nat Prod Lett，1994，5:141-146.

10 Yoshino M，Eto K，Takahashi K，et al.Organocatalytic asymmetric syntheses of inthomycins A，B and C.Org Biomol Chem，2012，10:8164-8174.

11 Henkel T，Zeeck A.Inthomycine，neue Oxazol-triene aus Streptomyces sp.Liebigs Ann Chem，1991，1991:367-373.

12 Sobolevskaya MP，Denisenko VA，Moiseenko AS，et al.Bioactive metabolites of the marine actinobacterium Streptomyces sp.KMM 7210.Russ Chem Bull，2007，56:838-840.

13 Zhang WJ，Wei SP，Zhang JW，et al.Antibacterial activity composition of the fermentation broth of Streptomyces djakartensis NW35.Molecules，2013，18:2763-2768.

14 Ji JJ(紀軍建)，Zhang XF(張小風)，Wang WQ(王文橋)，et al.Research progress on control of tomato GrayMold.Chin Agric Sci Bull(中國農(nóng)學通報)，2012，28:109-113.