疣孢漆斑菌發(fā)酵液的化學(xué)成分及其農(nóng)藥活性的研究

康 敏，郭大樂(lè)，胡 佳，萬(wàn) 波，周 燕，丁立生，顧玉誠(chéng)，鄧 赟*

1 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室—省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 611137;2 中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所 山地生態(tài)恢復(fù)與生物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041;3Syngenta Jealott’s Hill International Research Centre，Berkshire RG42 6EY，UK

疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)為半知菌亞門絲抱綱瘤座抱目瘤座抱科漆斑菌屬真菌。研究發(fā)現(xiàn)，疣孢漆斑菌對(duì)幾種重要的雜草物種(如野葛)具有較高的毒性［1］，且可直接作用于雜草或害蟲(chóng)目標(biāo)，而不引起繼發(fā)感染，實(shí)現(xiàn)對(duì)病蟲(chóng)害的有效控制，因此其在生物防治方面具有潛在的開(kāi)發(fā)價(jià)值。疣孢漆斑菌的主要代謝產(chǎn)物為單端孢霉烯族化合物(Trichothecenes)［2］，這類化合物屬于倍半萜環(huán)氧化合物，其C-12 和C-13 位之間形成的氧橋是一個(gè)活性基團(tuán)。當(dāng)C-4 和C-15 成酯后活性則增強(qiáng)。單端孢霉烯是疣孢漆斑菌的主要活性成分可與核糖體的S60 亞基結(jié)合，從而抑制蛋白的合成。這種抑制真核細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的特性，顯示出廣泛的生物活性，包括抗真菌［3］、抗微生物［4］、抗白血病［5］、抗腫瘤活性［6］以及用于農(nóng)藥防治的生物除草劑和殺蟲(chóng)劑［7］。

本文從羌活中得到一株內(nèi)生菌，對(duì)其發(fā)酵液乙酸乙酯部位進(jìn)行初步活性測(cè)試，結(jié)果表現(xiàn)出良好的殺蟲(chóng)和除草活性。該菌經(jīng)鑒定為疣孢漆斑菌，對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵，提取，分離，鑒定，得到得到一類共計(jì)14 個(gè)單端孢霉烯族化合物(Trichothecenes)，經(jīng)MS 及NMR 波譜解析技術(shù)分別鑒定了它們的結(jié)構(gòu)，最后對(duì)每個(gè)化合物做了除草及殺蟲(chóng)的活性測(cè)試，旨在研究出疣孢漆斑菌除草殺蟲(chóng)作用的化學(xué)成分基礎(chǔ)，對(duì)利用單端孢霉烯開(kāi)發(fā)成為生物除草劑和殺蟲(chóng)劑具有指導(dǎo)意義。

1 材料與儀器

1.1 菌種

由羌活體內(nèi)分離得到一株真菌(編號(hào)QH025)，通過(guò)形態(tài)鑒定和18S rDNA 比對(duì)分析，經(jīng)成都生物研究所萬(wàn)波副研究員鑒定為疣孢漆斑菌Myrothecium verrucaria，樣品目前存放于中國(guó)科學(xué)院成都生物所。

1.2 儀器與試劑

Micromass Xevo Triple-quadrupole 型質(zhì)譜儀(Waters 公司);Bruker Ascend 400 型核磁共振儀，TMS 為內(nèi)標(biāo);制備型HPLC 為Waters 2545 HPLC、Waters 2489 檢測(cè)器;色譜柱:kromasil RP-C18(19×250 mm，5 μm)、kromasil RP-C18(10×250 mm，5 μm);薄層色譜GF254和柱色譜硅膠(300～400 目)(青島海洋化工廠);實(shí)驗(yàn)所用試劑(分析純，成都科龍化工廠)。

1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA);發(fā)酵培養(yǎng)基:按可溶性淀粉0.8%，蛋白胨0.5%，NaCl 0.2%，CaCO30.2%，MgSO4·7 H2O 0.05%，K2HPO40.05%配制。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 真菌發(fā)酵

將疣孢漆斑菌Myrothecium verrucaria QH025 斜面菌種接種于30 瓶錐形瓶中(200 mL PDA 培養(yǎng)基/500 mL 錐形瓶)，培養(yǎng)3 d 得種子液，再接入200 瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(400 mL/1 L 錐形瓶)，在28 ℃、250 rpm 振搖培養(yǎng)14 d 得到發(fā)酵液。

2.2 發(fā)酵液的提取與分離

取發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液(80 L)，過(guò)濾，除去菌絲體，合并濾液，用等體積乙酸乙酯萃取，重復(fù)三次，合并萃取液，減壓蒸干濃縮得到乙酸乙酯部分浸膏25 g。

將乙酸乙酯部分浸膏25 g 經(jīng)正相硅膠柱層析，以石油醚:丙酮(10∶0→9.5∶0.5→9∶1→……→1∶1，v/v)梯度洗脫，收集洗脫液，TLC 指引合并，得到組份A(1.2 g)、B(0.7 g)、C(2.6 g)、D(2.3 g)、E(1.8 g)、F(0.4 g)、G(0.9 g)、H(1.5 g)。組份B經(jīng)反復(fù)制備HPLC，以甲醇-水洗脫，得到化合物1(23 mg)、2(17 mg)。組份C 繼續(xù)用硅膠柱色譜純化，石油醚:丙酮(30∶1～10∶1)梯度洗脫，得到3 個(gè)亞組份C1、C2、C3，3 個(gè)亞組份經(jīng)反復(fù)制備HPLC 純化，從C1 中得到化合物3(11 mg)、4(13 mg)，C2 中得到化合物5(12 mg)，C3 中得到化合物6(10 mg)。組份D 經(jīng)硅膠柱層析，石油醚:丙酮(20∶1～10∶1)梯度洗脫，得到5 個(gè)亞組份D1、D2、D3、D4、D5。經(jīng)制備HPLC 純化，從D1 中得到化合物7(9 mg)、8(16 mg)，從D3 中得到化合物9(14 mg)，從D4 中得到化合物10(12 mg)。組份E 經(jīng)硅膠柱層析，石油醚:丙酮(20∶1～10∶1)梯度洗脫，得到化合物3個(gè)亞組份E1、E2、E3，再經(jīng)反復(fù)制備HPLC 純化，從E2 中得到化合物11(10 mg)，E3 中得到化合物12(18 mg)、13(11 mg)。組份F 經(jīng)反復(fù)制備HPLC 純化，得到化合物14(19 mg)。

2.3 分離成分農(nóng)藥活性測(cè)定

2.3.1 除草活性測(cè)試

根據(jù)文獻(xiàn)［8］中的方法，對(duì)14 個(gè)化合物樣品進(jìn)行除草活性測(cè)試。分別用10 ppm、32 ppm 測(cè)試樣品對(duì)雜草植物擬南芥、早熟禾的除草作用，測(cè)試板在特定條件下保存7 d。每個(gè)樣品平行做兩次，取其平均值。

2.3.2 殺蟲(chóng)活性測(cè)試

根據(jù)文獻(xiàn)［8］中的方法，對(duì)14 個(gè)化合物樣品做了殺蟲(chóng)活性測(cè)試。采用小葉塊測(cè)試法，用1000 ppm 對(duì)綠棉鈴蟲(chóng)進(jìn)行測(cè)試。每個(gè)樣品平行做三次，取其平均值。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色無(wú)定型粉末;ESI-MS m/z:501(［M+H］+);1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7.91(1H，dd，J=15.8，11.4 Hz，H-8＇)，6.65(1H，t，J=11.3 Hz，H-9＇)，6.19(1H，d，J=11.2 Hz，H-7＇)，6.08(1H，d，J=15.8 Hz，H-10＇)，5.86(1H，dd，J=8.6 Hz，4.2 Hz，H-4)，5.45(1H，d，J=5.2 Hz，H-10)，4.52(1H，d，J=12.4 Hz，H-15β)，4.29-4.43(3H，m，H-15α，5＇)，3.87(1H，d，J=5.0 Hz，H-2)，3.61(1H，d，J=5.3 Hz，H-11)，3.41(1H，s，H-2＇)，3.16(1H，d，J=3.9 Hz，H-13β)，2.85(1H，d，J=3.9 Hz，H-13α)，2.50(1H，dd，J=13.2 Hz，8.3 Hz，H-3β)，2.33(1H，td，J=15.5，6.0，2.7 Hz，H-4＇β)，2.22(1H，m，H-4＇α)，1.76(3H，s，H-16)，1.72(1H，m，H-3α)，1.70～2.20(4H，m，H-7，8)，1.60(3H，s，H-12＇)，0.90(3H，s，H-14);13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:167.3(C-1＇)，166.0(C-11＇)，165.0(C-6＇)，140.4(C-9)，138.3(C-8＇)，138.3(C-9＇)，127.5(C-10＇)，125.5(C-7＇)，117.9(C-10)，78.9(C-2)，75.5(C-4)，67.1(C-11)，64.8(C-12)，63.8(C-15)，61.3(C-3＇)，60.5(C-5＇)，58.2(C-2＇)，49.2(C-5)，47.6(C-13)，43.8(C-6)，37.0(C-4＇)，35.0(C-3)，27.5(C-8)，23.0(C-16)，20.0(C-7)，15.9(C-12＇)，7.2(C-14)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9，10］報(bào)道的疣孢菌素B(verrucarin B)的碳譜核磁數(shù)據(jù)基本一致，故確定該化合物為疣孢菌素B(verrucarin B)。

化合物2 白色無(wú)定型粉末;ESI-MS m/z:571(［M+H］+);1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7.66(1H，m，H-8＇)，6.58(1H，t，J=11.4 Hz，H-9＇)，5.97(1H，dd，J=15.3，2.2 Hz，H-7＇)，5.92(1H，dd，J=8.3，4.4 Hz，H-4)，5.81(1H，d，J=11.1 Hz，H-10＇)，5.73(1H，d，J=5.3 Hz，H-10)，5.65(1H，s，H-2＇)，5.54(1H，dd，J=8.6，3.4 Hz，H-5＇)，5.20(1H，d，J=5.4 Hz，H-8)，4.42(1H，d，J=12.2 Hz，H-15β)，4.37(1H，d，J=12.2 Hz，H-15α)，4.08(1H，d，J=8.6 Hz，H-6＇)，3.85(1H，d，J=5.0 Hz，H-2)，3.77(1H，d，J=5.5 Hz，H-11)，3.68(1H，dq，J=12.1，5.9 Hz，H-13＇)，3.12(1H，d，J=3.9 Hz，H-13β)，2.85(1H，d，J=4.0 Hz，H-13α)，2.67(1H，dd，J=12.3 Hz，H-4＇β)，2.50(1H，dd，J=15.4 Hz，8.3 Hz，H-3β)，2.29(3H，s，H-12＇)，2.10～2.27(4H，m，H-3α，7，4＇α)，1.94(3H，s，H-18)，1.77(3H，s，H-16)，1.36(3H，d，J=6.0 Hz，H-14＇)，0.85(3H，s，H-14);13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:170.9(C-17)，166.2(C-11＇)，165.8(C-1＇)，155.2(C-3＇)，143.2(C-9＇)，136.4(C-9)，134.9(C-7＇)，126.0(C-8＇)，123.9(C-10)，118.6(C-2＇)，118.4(C-10＇)，100.6(C-5＇)，81.9(C-6＇)，79.1(C-2)，76.6(C-13＇)，73.4(C-4)，68.7(C-8)，67.2(C-11)，65.4(C-12)，64.5(C-15)，49.0(C-5)，47.9(C-13)，47.7(C-4＇)，42.0(C-6)，34.6(C-3)，26.2(C-7)，20.9(C-18)，20.5(C-16)，18.2(C-12＇)，16.4(C-14＇)，7.2(C-14)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道的8-乙?；岚呔豀(8-acetoxyroridin H)的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故確定該化合物為8-乙?；岚呔?8-acetoxyroridin H)。

化合物3 白色無(wú)定型粉末;ESI-MS m/z:501(［M+H］+);1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7.99(1H，dd，J=15.7，11.7 Hz，H-8＇)，6.65(1H，t，J=11.7 Hz，H-9＇)，6.18(1H，d，J=11.7 Hz，H-10＇)，6.03(1H，d，J=15.7 Hz，H-7＇)，5.84(1H，s，H-2＇)，5.76(1H，d，J=3.2 Hz，H-4)，5.58(1H，d，J=5.1 Hz，H-10)，4.46(1H，m，H-3)，4.42(1H，d，J=12.7 Hz，H-15β)，4.40～4.50(1H，m，H-5＇β)，4.22(1H，d，J=5.5 Hz，H-11)，4.13～4.40(1H，m，H-3)，4.04(1H，d，J=12.7 Hz，H-15α)，3.72(1H，d，J=4.9 Hz，H-2)，3.11(1H，d，J=3.9 Hz，H-13β)，2.82(1H，d，J=3.9 Hz，H-13α)，2.40-2.60(2H，m，H-8β，4＇β)，2.28(3H，s，H-12＇)，2.00～2.10(3H，m，H-7β，8α，4＇α)，1.75(3H，s，H-16)，1.72(1H，m，H-7α)，0.83(3H，s，H-14);13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:166.5(C-6＇)，166.2(C-1＇)，165.6(C-11＇)，157.1(C-3＇)，140.3(C-9)，139.5(C-9＇)，139.1(C-8＇)，127.7(C-7＇)，125.6(C-10＇)，118.9(C-2＇)，118.3(C-10)，84.0(C-4)，79.3(C-2)，77.1(C-3)，68.3(C-11)，64.7(C-12)，63.6(C-15)，60.7(C-5＇)，49.1(C-5)，47.5(C-13)，43.9(C-6)，40.4(C-4＇)，27.8(C-8)，23.5(C-16)，21.2(C-7)，17.5(C-12＇)，7.1(C-14)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］報(bào)道的疣孢菌素M(verrucarin M)的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故確定該化合物為疣孢菌素M(verrucarin M)。

化合物4 白色無(wú)定型粉末;ESI-MS m/z:485(［M+H］+);1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:8.06(1H，dd，J=15.2，11.5 Hz，H-8＇)，6.62(1H，dd，J=11.5，11.5 Hz，H-9＇)，6.18(1H，d，J=11.5 Hz，H-10＇)，6.11(1H，d，J=15.2 Hz，H-7＇)，6.10(1H，m，H-4)，5.82(1H，dd，J=8.2，4.3 Hz，H-4)，5.45(1H，d，J=5.1 Hz，H-10)，4.82(1H，d，J=12.2 Hz，H-15β)，4.52(1H，m，H-5＇β)，4.23(1H，d，J=12.2 Hz，H-15α)，4.16(1H，s，H-2＇)，4.00(1H，m，H-5＇α)，3.88(1H，d，J=5.2 Hz，H-2)，3.59(1H，d，J=5.1 Hz，H-11)，3.14(1H，d，J=4.1 Hz，H-13β)，2.82(1H，d，J=4.1 Hz，H-13α)，2.48～2.60(3H，m，H-3β，4＇)，2.18(1H，m，H-3α)，1.80～

2.10 (4H，m，H-7，8)，1.73(3H，s，H-16)，0.90(3H，s，H-12＇)，0.83(3H，s，H-14);13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:166.1(C-6＇)，165.8(C-1＇)，165.5(C-11＇)，156.6(C-3＇)，140.5(C-9)，139.5(C-9＇)，139.1(C-8＇)，127.4(C-7＇)，125.5(C-10＇)，118.6(C-2＇)，118.1(C-10)，79.0(C-2)，75.3(C-4)，67.3(C-11)，65.5(C-12)，63.3(C-15)，60.4(C-5＇)，48.8(C-5)，48.2(C-13)，43.0(C-6)，40.2(C-4＇)，35.1(C-3)，27.6(C-8)，23.3(C-16)，20.7(C-7)，17.2(C-12＇)，7.0(C-14)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］報(bào)道的疣孢菌素J(verrucarin J)的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故確定該化合物為疣孢菌素J(verrucarin J)。

化合物5 白色無(wú)定型粉末;ESI-MS m/z:531(［M+H］+);1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7.54(1H，dd，J=15.4，11.2 Hz，H-8＇)，6.62(1H，t，J=11.2 Hz，H-9＇)，5.98(1H，dd，J=15.7，3.0 Hz，H-7＇)，5.85(1H，m，H-4)，5.81(1H，m，H-10＇)，5.45(1H，d，J=4.5 Hz，H-10)，4.39(1H，d，J=12.4 Hz，H-15β)，4.28(1H，d，J=12.4 Hz，H-15α)，3.87(1H，d，J=6.2 Hz，H-2)，3.81(1H，m，H-6＇)，3.60-3.70(3H，m，H-11，5＇)，3.50(1H，s，H-2＇)，3.33(1H，m，H-13＇)，3.14(1H，d，J=3.9 Hz，H-13β)，2.83(1H，d，J=3.9 Hz，H-13α)，2.43～2.54(1H，m，H-3β)，2.00-2.24(2H，m，H-4＇)，1.79～1.98(5H，m，H-3α，7，8)，1.75(3H，s，H-16)，1.63(3H，s，H-12＇)，1.22(3H，d，J=6.0 Hz，H-14＇)，0.85(3H，s，H-14);13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:167.89(C-1＇)，166.34(C-11＇)，143.10(C-9＇)，140.06(C-9)，138.17(C-7＇)，126.28(C-8＇)，118.44(C-10)，118.11(C-10＇)，85.71(C-6＇)，79.01(C-2)，74.42(C-4)，70.91(C-13＇)，67.40(C-5＇)，66.96(C-11)，65.33(C-12)，64.54(C-15)，63.22(C-3＇)，58.19(C-2＇)，49.19(C-5)，47.77(C-13)，43.23(C-6)，39.62(C-4＇)，35.11(C-3)，27.55(C-8)，23.27(C-16)，20.53(C-7)，18.20(C-14＇)，17.41(C-12＇)，6.99(C-14)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］報(bào)道的漆斑菌素D(roridin D)的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故確定該化合物為漆斑菌素D(roridin D)。

化合物6 白色無(wú)定型粉末;ESI-MS m/z:543(［M+H］+)，565(［M+Na］+);1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:8.02(1H，dd，J=15.9，11.2 Hz，H-8＇)，6.64(1H，t，J=11.2 Hz，H-9＇)，6.09(1H，d，J=11.2 Hz，H-7＇)，6.03(1H，d，J=15.9 Hz，H-10＇)，5.94(1H，dd，J=8.2，4.3 Hz，H-4)，5.78(1H，s，H-2＇)，5.72(1H，d，J=5.0 Hz，H-10)，5.21(1H，m，H-8)，4.57(1H，d，J=12.5 Hz，H-15β)，4.52(1H，td，J=11.2，4.0 Hz，H-5＇β)，4.23(1H，d，J=12.5 Hz，H-15α)，4.13(1H，m，H-5＇α)，3.86(1H，d，J=5.1 Hz，H-11)，3.81(1H，d，J=5.6 Hz，H-2)，3.13(1H，d，J=3.9 Hz，H-13β)，2.87(1H，d，J=3.9 Hz，H-13α)，2.40～2.60(3H，m，H-3α，4＇)，2.30(3H，s，H-12＇)，2.10～2.30(3H，m，H-3β，7)，1.97(3H，s，H-18)，1.78(3H，s，H-16)，0.83(3H，s，H-14);13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:170.9(C-13＇)，165.8(C-11＇)，165.6(C-6＇)，165.5(C-1＇)，157.0(C-3＇)，140.0(C-8＇)，138.7(C-9＇)，136.4(C-9)，127.8(C-7＇)，125.1(C-10＇)，123.8(C-10)，117.7(C-2＇)，78.9(C-2)，74.7(C-4)，68.8(C-8)，66.9(C-11)，65.3(C-12)，64.4(C-15)，60.4(C-5＇)，48.9(C-5)，47.9(C-13)，42.1(C-6)，40.1(C-4＇)，34.8(C-3)，26.3(C-7)，21.8(C-16)，20.5(C-14＇)，17.1(C-12＇)，7.0(C-14)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］報(bào)道的乙?；噫呔豅(verrucarin L acetate)的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故確定該化合物為乙?；噫呔豅(verrucarin L acetate)。

化合物7 白色晶體;ESI-MS m/z:515(［M+H］+);1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7.60(1H，dd，J=15.8，11.0 Hz，H-8＇)，6.63(1H，t，J=11.0 Hz，H-9＇)，6.39(1H，dd，J=8.0，4.1 Hz，H-4)，5.88(1H，s，H-2＇)，5.85(1H，d，J=4.6 Hz，H-10＇)，5.73(1H，dd，J=15.8，6.3 Hz，H-7＇)，5.53(1H，d，J=5.18 Hz，H-10)，4.05～4.20(3H，m，H-11，15)，3.87(1H，d，J=5.0 Hz，H-2)，3.85(1H，m，H-6＇)，3.70-3.80(2H，m，H-5＇α，13＇)，3.47-3.55(1H，m，H-5＇β)，3.20(1H，d，J=3.9 Hz，H-13β)，2.85(1H，d，J=3.9 Hz，H-13α)，2.55～2.65(3H，m，H-3β，4＇)，2.25(3H，s，H-12＇)，1.98～2.57(5H，m，H-3α，7，8)，1.75(3H，s，H-16)，1.19(3H，d，J=5.8 Hz，H-14＇)，0.82(3H，s，H-14);13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:166.3(C-1＇)，166.3(C-11＇)，158.0(C-3＇)，142.0(C-9＇)，140.2(C-9)，135.1(C-7＇)，131.1(C-8＇)，119.5(C-2＇)，118.8(C-10)，117.0(C-10＇)，83.1(C-6＇)，79.2(C-2)，75.3(C-4)，69.7(C-13＇)，67.0(C-5＇)，66.7(C-11)，65.7(C-12)，64.5(C-15)，48.5(C-5)，47.6(C-13)，42.5(C-6)，39.8(C-4＇)，36.6(C-3)，27.6(C-8)，23.2(C-16)，22.6(C-7)，19.8(C-12＇)，18.5(C-14＇)，6.4(C-14)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］報(bào)道的異漆斑菌素E(isororidin E)的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故確定該化合物為異漆斑菌素E(isororidin E)。

化合物8 針狀白色晶體;ESI-MS m/z:515(［M+H］+);1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7.50(1H，dd，J=15.8，11.4 Hz，H-8＇)，6.56(1H，t，J=11.3 Hz，H-9＇)，6.18(1H，dd，J=8.0，3.9 Hz，H-4)，5.93(1H，s，H-2＇)，5.89(1H，d，J=4.0 Hz，H-10＇)，5.72(1H，dd，J=11.3，4.7 Hz，H-7＇)，5.46(1H，d，J=5.1 Hz，H-10)，4.30(1H，d，J=12.54 Hz，H-15α)，3.91(1H，d，J=12.54 Hz，H-15β)，3.88(1H，d，J=12.54 Hz，H-2)，3.82(1H，d，J=5.1 Hz，H-11)，3.60～3.69(2H，m，H-5＇α，13＇)，3.51-3.58(1H，m，H-5＇β)，3.12(1H，d，J=4.2 Hz，H-13β)，2.80(1H，d，J=4.2 Hz，H-13α)，2.45～2.55(3H，m，H-3β，4＇)，2.25(3H，s，H-12＇)，1.95-2.60(5H，m，H-3α，7，8)，1.69(3H，s，H-16)，1.17(3H，d，J=6.0 Hz，H-14＇)，0.77(3H，s，H-14);13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:166.4(C-1＇)，165.8(C-11＇)，159.2(C-3＇)，143.7(C-9＇)，140.2(C-9)，138.2(C-7＇)，126.5(C-8＇)，118.8(C-10)，117.6(C-10＇)，117.1(C-2＇)，83.7(C-6＇)，79.2(C-2)，74.1(C-4)，70.4(C-13＇)，69.7(C-5＇)，67.2(C-11)，65.5(C-12)，63.7(C-15)，48.4(C-5)，48.1(C-13)，42.7(C-6)，41.2(C-4＇)，35.7(C-3)，27.7(C-8)，23.2(C-16)，21.5(C-7)，20.2(C-12＇)，18.2(C-14＇)，6.7(C-14)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［16］報(bào)道的漆斑菌素E(Roridin E)的核磁數(shù)據(jù)相吻合，故確定該化合物為漆斑菌素E(Roridin E)。

化合物9 白色無(wú)定型粉末;ESI-MS m/z:513(［M+H］+);1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7.71(1H，m，H-8＇)，6.58(1H，t，J=11.3 Hz，H-9＇)，5.97(1H，dd，J=13.2，0.8 Hz，H-7＇)，5.94(1H，m，H-4)，5.83(1H，d，J=11.2 Hz，H-10＇)，5.70(1H，s，H-2＇)，5.56(1H，dd，J=8.4，3.2 Hz，H-5＇)，5.46(1H，J=0.8 Hz，H-10)，4.35(1H，d，J=12.4 Hz，H-15β)，4.03～4.11(2H，m，H-15α，H-6＇)，3.87(1H，d，J=4.9 Hz，H-2)，3.69(2H，m，H-11，13＇)，3.15(1H，d，J=4.0 Hz，H-13β)，2.85(1H，d，J=3.9 Hz，H-13α)，2.67(1H，d，J=12.7 Hz，H-4＇β)，2.50(1H，dd，J=15.2，8.3 Hz，H-3β)，2.30(3H，s，H-12＇)，2.15-2.27(2H，m，H-3α，4＇α)，1.86～2.09(4H，m，H-7，8)，1.73(3H，s，H-16)，1.36(3H，d，J=6.1 Hz，H-14＇)，0.88(3H，s，H-14);13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:166.2(C-1＇)，166.2(C-11＇)，154.7(C-3＇)，142.7(C-9＇)，140.3(C-9)，134.8(C-7＇)，126.2(C-8＇)，119.0(C-2＇)，118.8(C-10＇)，118.7(C-10)，100.8(C-5＇)，81.9(C-6＇)，79.0(C-2)，77.0(C-13＇)，74.0(C-4)，67.7(C-11)，65.5(C-12)，63.2(C-15)，49.0(C-5)，47.8(C-4＇)，47.5(C-13)，43.2(C-6)，34.8(C-3)，27.6(C-8)，23.2(C-16)，20.5(C-7)，18.3(C-12＇)，16.5(C-14＇)，7.2(C-14)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［17］報(bào)道的漆斑菌素H(Roridin H)的核磁數(shù)據(jù)相吻合，故確定該化合物為漆斑菌素H(Roridin H)。

化合物10 片狀晶體;ESI-MS m/z:533(［M+H］+);1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7.67(1H，dd，J=15.4，11.7 Hz，H-8＇)，6.66(1H，dd，J=11.3，11.3 Hz，H-9＇)，6.01(1H，dd，J=15.5，3.1 Hz，H-7＇)，5.82(1H，m，H-10＇)，5.79(1H，t，J=4.7 Hz，H-4)，5.44(1H，d，J=5.2 Hz，H-10)，4.44(2H，s，H-15)，4.11(1H，s，H-2＇)，3.86(1H，d，J=5.1 Hz，H-2)，3.50～3.70(5H，m，H-11，5＇，6＇，13＇)，3.12(1H，d，J=4.0 Hz，H-13β)，2.81(1H，d，J=4.0 Hz，H-13α)，2.64(1H，s，H-13＇)，2.46(1H，m，H-3β)，2.22(1H，m，H-3α)，1.80～2.10(7H，m，H-7，8，3＇，4＇β)，1.75(3H，s，H-16)，1.58～1.69(1H，m，H-4＇α)，1.21(3H，d，J=7.0 Hz，H-14＇)，1.10(3H，d，J=6.1 Hz，H-12＇)，0.82(3H，s，H-14);13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:174.9(C-1＇)，166.5(C-11＇)，143.9(C-9＇)，141.0(C-9)，139.2(C-7＇)，126.1(C-8＇)，118.2(C-10)，117.5(C-10＇)，84.0(C-6＇)，79.1(C-2)，75.6(C-2＇)，74.3(C-4)，70.8(C-13＇)，69.9(C-5＇)，67.2(C-11)，65.3(C-12)，64.6(C-15)，49.4(C-5)，47.8(C-13)，43.8(C-6)，37.1(C-3＇)，34.8(C-3)，33.0(C-4＇)，27.7(C-8)，23.3(C-16)，20.3(C-7)，18.2(C-14＇)，14.7(C-12＇)，7.5(C-14)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［18］報(bào)道的漆斑菌素A(Roridin A)的核磁數(shù)據(jù)相吻合，故確定該化合物為漆斑菌素A(Roridin A)。

化合物11 白色無(wú)定型粉末;ESI-MS m/z:557(［M+H］+);1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7.48(1H，dd，J=15.4，11.3 Hz，H-8＇)，6.59(1H，t，J=11.2 Hz，H-9＇)，6.27(1H，dd，J=8.1，4.1 Hz，H-4)，5.88(1H，s，H-2＇)，5.81～5.87(2H，m，H-7＇，10＇)，5.51(1H，d，J=5.0 Hz，H-10)，5.09(1H，m，H-13＇)，4.28(1H，d，J=12.5 Hz，H-15β)，3.98～4.05(3H，m，H-11，15α，6＇)，3.87(1H，d，J=5.1 Hz，H-2)，3.65～3.82(2H，m，H-5＇)，3.17(1H，d，J=4.0 Hz，H-13β)，2.85(1H，d，J=4.0 Hz，H-13α)，2.47-2.60(2H，m，H-4＇)，2.35～2.43(1H，m，H-3β)，2.26(3H，s，H-12＇)，2.08(3H，s，H-16＇)，2.00-2.10(4H，m，H-3α，7β，8)，1.73(3H，s，H-16)，1.62(1H，m，H-7α)，1.19(3H，d，J=6.0 Hz，H-14＇)，0.82(3H，s，H-14);13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:170.5(C-15＇)，166.4(C-11＇)，166.3(C-1＇)，159.2(C-3＇)，143.2(C-9＇)，140.3(C-9)，137.6(C-7＇)，127.7(C-8＇)，119.1(C-10)，117.7(C-10＇)，117.4(C-2＇)，79.5(C-2)，79.2(C-6＇)，74.3(C-4)，70.5(C-13＇)，69.1(C-11)，67.6(C-5＇)，65.6(C-12)，63.8(C-15)，48.4(C-5)，48.1(C-13)，42.7(C-6)，41.5(C-4＇)，35.7(C-3)，27.7(C-8)，23.3(C-16)，21.5(C-7)，21.3(C-16＇)，19.5(C-12＇)，14.8(C-14＇)，6.7(C-14)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［19］報(bào)道的乙酰基漆斑菌素E(roridin E acetate)的核磁數(shù)據(jù)相吻合，故確定該化合物為乙酰基漆斑菌素E(roridin E acetate)。

化合物12 黃色膠質(zhì)狀;ESI-MS m/z:533(［M+H］+);1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7.58(1H，t，J=12.8 Hz，H-4＇)，6.63(1H，t，J=11.6 Hz，H-3＇)，6.24(1H，dd，J=15.5，7.6 Hz，H-4)，6.11(1H，dd，J=15.5，4.7 Hz，H-5＇)，5.89(1H，d，J=1.0 Hz，H-2＇＇)，5.72(1H，d，J=11.5 Hz，H-2＇)，5.50(1H，d，J=5.0 Hz，H-10)，4.07(1H，m，H-6＇)，4.03(1H，d，J=5.0 Hz，H-11)，3.88(1H，d，J=5.1 Hz，H-2)，3.82(1H，d，J=12.3 Hz，H-15β)，3.60～3.92(3H，m，H-7＇，5＇＇)，3.65(1H，d，J=12.3 Hz，H-15α)，3.19(1H，d，J=4.0 Hz，H-13β)，2.87(1H，d，J=4.0 Hz，H-13α)，2.60(2H，m，H-3)，2.45(2H，m，H-4＇＇)，2.22(3H，d，J=1.0 Hz，H-6＇＇)，1.56～2.08(4H，m，H-7，8)，1.74(3H，s，H-16)，1.19(3H，d，J=6.3 Hz，H-8＇)，0.83(3H，s，H-14);13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:166.0(C-1＇)，165.9(C-1＇＇)，157.1(C-3＇＇)，143.8(C-3＇)，142.2(C-5＇)，140.5(C-9)，127.0(C-4＇)，118.5(C-10)，118.1(C-4＇)，116.9(C-2＇＇)，79.1(C-2)，76.1(C-6＇)，75.0(C-4)，70.6(C-7＇)，66.6(C-11)，65.8(C-12)，63.4(C-15)，59.6(C-5＇＇)，48.6(C-5)，48.2(C-13)，43.9(C-4＇＇)，43.6(C-6)，36.9(C-3)，27.9(C-8)，23.2(C-16)，21.8(C-7)，19.1(C-6＇＇)，18.9(C-8＇)，6.7(C-14)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［20］報(bào)道的Isotrichoverrin A 的核磁數(shù)據(jù)相吻合，故確定該化合物為Isotrichoverrin A。

化合物13 黃色膠質(zhì)狀;ESI-MS m/z:533(［M+H］+);1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7.56(1H，dd，J=15.5，11.3 Hz，H-4＇)，6.63(1H，dd，J=11.4，11.3 Hz，H-3＇)，6.11-6.21(1H，m，H-5＇)，6.10(1H，m，H-4)，5.85(1H，d，J=1.0 Hz，H-2＇＇)，5.70(1H，d，J=11.3 Hz，H-2＇)，5.49(1H，d，J=5.4 Hz，H-10)，4.25(1H，m，H-6＇)，3.98(1H，d，J=5.4 Hz，H-11)，3.93(1H，m，H-7＇)，3.85(1H，d，J=5.2 Hz，H-2)，3.81(1H，d，J=12.3 Hz，H-15β)，3.75-3.80(2H，m，H-5＇＇)，3.64(1H，d，J=12.3 Hz，H-15α)，3.17(1H，d，J=4.0 Hz，H-13β)，2.86(1H，d，J=4.0 Hz，H-13α)，2.58(1H，dd，J=7.8，15.4 Hz，H-3β)，2.42(2H，t，J=6.0 Hz，H-4＇＇)，2.19(3H，d，J=1.1 Hz，H-6＇＇)，2.18(1H，m，H-3α)，1.91～2.16(3H，m，H-7β，8)，1.72(3H，s，H-16)，1.59(1H，m，H-7α)，1.14(3H，d，J=6.5 Hz，H-8＇)，0.81(3H，s，H-14);13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:166.1(C-1＇)，166.0(C-1＇＇)，157.2(C-3＇＇)，144.1(C-3＇)，141.4(C-5＇)，140.5(C-9)，127.5(C-4＇)，118.5(C-10)，117.8(C-2＇)，116.8(C-2＇＇)，79.1(C-2)，75.4(C-6＇)，75.1(C-4)，70.2(C-7＇)，66.6(C-11)，65.8(C-12)，63.4(C-15)，59.5(C-5＇＇)，48.5(C-5)，48.2(C-13)，43.6(C-4＇＇)，42.8(C-6)，36.9(C-3)，27.8(C-8)，23.2(C-16)，21.9(C-7)，19.2(C-6＇＇)，17.9(C-8＇)，6.7(C-14)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［20］報(bào)道的Isotrichoverrin B 的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故確定該化合物為Isotrichoverrin B。

化合物14 無(wú)色塊狀晶體;ESI-MS m/z:503(［M+H］+);1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:8.06(1H，dd，J=15.5，11.7 Hz，H-8＇)，6.69(1H，dd，J=11.3，11.3 Hz，H-9＇)，6.18(1H，d，J=11.05 Hz，H-10＇)，6.07(1H，d，J=15.6 Hz，H-7＇)，5.82(1H，dd，J=8.1，4.1 Hz，H-4)，5.45(1H，d，J=5.2 Hz，H-10)，4.82(1H，d，J=12.1 Hz，H-15β)，4.52(1H，dq，J=11.45，2.33 Hz，H-5＇β)，4.23(1H，d，J=12.1 Hz，H-15α)，4.16(1H，d，J=1.8 Hz，H-2＇)，4.00(1H，td，J=11.9，3.3 Hz，H-5＇α)，3.88(1H，d，J=5.08 Hz，H-2)，3.59(1H，d，J=5.2 Hz，H-11)，3.14(1H，d，J=3.9 Hz，H-13β)，2.82(1H，d，J=3.9 Hz，H-13α)，2.50(1H，m，H-3β)，2.20～2.40(4H，m，H-3α，2＇，3＇)，1.90～2.00(4H，m，H-7β，8，4＇β)，1.75(3H，s，H-16)，1.70-1.80(2H，m，H-7α，4＇α)，0.90(3H，d，J=6.75，H-12＇)，0.87(3H，s，H-14);13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:174.7(C-1＇)，166.1(C-11＇)，165.4(C-6＇)，141.1(C-9)，138.9(C-9＇)，138.8(C-8＇)，127.5(C-7＇)，125.8(C-10＇)，117.9(C-10)，78.9(C-4)，75.5(C-2)，74.2(C-2＇)，66.9(C-11)，65.2(C-12)，63.5(C-15)，61.1(C-5＇)，49.5(C-5)，47.8(C-13)，44.2(C-6)，34.9(C-3)，33.2(C-3＇)，32.2(C-4＇)，27.5(C-8)，23.3(C-16)，20.0(C-7)，10.0(C-12＇)，7.3(C-14)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［18］報(bào)道的疣孢菌素A(verrucarin A)的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故確定該化合物為疣孢菌素A(verrucarin A)。

圖1 化合物1～14 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-14

3.2 農(nóng)藥活性

3.2.1 除草活性測(cè)試

測(cè)試了14 個(gè)化合物樣品的除草活性。測(cè)試結(jié)果以測(cè)試值99 或0 表示，其中，99 表示測(cè)試樣品能完全抑制雜草的生長(zhǎng)，具有顯著的除草活性，0 表示該樣品沒(méi)有除草活性。測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。試驗(yàn)表明，除化合物11 外，其余化合物以10 ppm 的濃度對(duì)擬南芥都有顯著的生長(zhǎng)抑制作用;大多數(shù)化合物以32 ppm 的濃度對(duì)早熟禾有生長(zhǎng)抑制作用。

3.2.2 殺蟲(chóng)活性測(cè)試

測(cè)試了14 個(gè)化合物樣品的殺蟲(chóng)活性。相對(duì)于對(duì)照組，樣品的測(cè)試結(jié)果以死亡率評(píng)估，采用99 或0 來(lái)表示，其中99 表明樣品對(duì)害蟲(chóng)的死亡率超過(guò)70%，0 表明死亡率不顯著或沒(méi)有死亡，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。試驗(yàn)表明，除化合物12 外，其余化合物在1000 ppm 的濃度下，對(duì)綠棉鈴蟲(chóng)致死率大于70%。

表1 化合物1～14 的除草殺蟲(chóng)活性測(cè)試結(jié)果Table 1 Herbcidal and pesticidal activities of compounds 1 to 14

4 結(jié)果與討論

一直以來(lái)，植物草害和蟲(chóng)害都是導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)的主要影響因素。而如今由于化學(xué)除草劑和殺蟲(chóng)劑的廣泛使用，對(duì)環(huán)境造成了重大的災(zāi)害;近年來(lái)，為了取代化學(xué)農(nóng)藥，開(kāi)啟農(nóng)業(yè)綠色革命，生物防治已成為研究的熱點(diǎn)。生物除草劑或殺蟲(chóng)劑相對(duì)于化學(xué)農(nóng)藥，不僅具有良好的防治效果，而且還具有不污染環(huán)境，不影響人類的健康等優(yōu)點(diǎn)。特別是針對(duì)一些特定生物或外侵生物(如水葫蘆［21］)入侵時(shí)，化學(xué)防治或人工機(jī)械拔出費(fèi)用太高而達(dá)不到有效控制時(shí)，采取合適的生物防治能得到有效治理。

本文從羌活內(nèi)生菌疣孢漆斑菌發(fā)酵液的乙酸乙酯部位分離得到14 個(gè)單端孢霉烯類化合物，其中化合物2、6、7 為首次從該種真菌中分離得到。我們通過(guò)對(duì)化合物做了農(nóng)藥活性測(cè)試試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10 ppm 的化合物對(duì)擬南芥有顯著的生長(zhǎng)抑制作用，32 ppm 對(duì)早熟禾有生長(zhǎng)抑制作用，1000 ppm 對(duì)綠棉鈴蟲(chóng)的致死率大于70%。這些次生代謝產(chǎn)物具有除草，殺蟲(chóng)的作用，尤其對(duì)雜草擬南芥和綠棉鈴蟲(chóng)的作用效果甚好。為單端孢霉烯的利用提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)于將單端孢霉烯類化合物開(kāi)發(fā)為生物除草劑和在棉花的種植中用于殺滅綠棉鈴蟲(chóng)都有很好的開(kāi)發(fā)利用前景。

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