P4對雙氧水誘導SH-SY 5Y細胞凋亡的保護作用

金鑫，陰育紅，馬婷

1.黑龍江佳木斯市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，黑龍江佳木斯 154000；2.黑龍江省佳木斯市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，黑龍江佳木斯 154000

P4對雙氧水誘導SH-SY 5Y細胞凋亡的保護作用

金鑫1，陰育紅1，馬婷2

1.黑龍江佳木斯市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，黑龍江佳木斯 154000；2.黑龍江省佳木斯市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，黑龍江佳木斯 154000

目的研究P4對雙氧水誘導SH-SY5Y細胞凋亡的影響。方法體外培養(yǎng)SH-SY5Y細胞，建立雙氧水誘導SH-SY5Y細胞凋亡的模型，給予P4進行干預(yù)。應(yīng)用Hoechst染色，測定細胞凋亡率。結(jié)果10uM的雙氧水24 h可以使SH-SY5Y細胞凋亡率達到（56.33±13.17）%。然而，給予P4后，SH-SY5Y細胞的凋亡率明顯減低,P4加雙氧水組與雙氧水組對比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論P4對SH-SY5Y細胞的凋亡有保護作用。

P4；雙氧水；SH-SY5Y細胞；Hoechst33258染色

氧化應(yīng)激長期以來被認為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病(如阿爾茨海默病)神經(jīng)元損傷的一個主要因素。氧化應(yīng)激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基和活性氮自由基產(chǎn)生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導致組織損傷[1-3]?；钚匝踝杂苫ǔ蹶庪x子（·O2-）、羥自由基（·OH）和過氧化氫（H2O2）等。過氧化氫（H2O2），作為主要的活性氧，可以改變細胞的細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，誘導氧化損傷其轉(zhuǎn)化成高反應(yīng)性的羥基自由基。此外，過氧化氫和羥基自由基導致線粒體的結(jié)構(gòu)和功能的損傷，引起細胞凋亡。因此，過氧化氫已經(jīng)被廣泛使用在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)毒性和神經(jīng)保護作用的氧化應(yīng)激細胞培養(yǎng)模型中[4]。SH-SY5Y是一種分化程度較低的腫瘤細胞，顯示中水平的多巴胺-β-羥基酶活性，細胞形態(tài)、生理及生化功能與正常神經(jīng)細胞相似，并具有明顯的軸突[5]。有研究表明，P4不僅用于生殖系統(tǒng)，而且對中樞神經(jīng)系統(tǒng)也有保護作用[6]。該實驗主要研究P4對SH-SY5Y細胞的保護作用及機制，為臨床治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病提供實驗數(shù)據(jù)。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年3—10月期間培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞作為實驗樣本，把分化1周的SH-SY5Y細胞分為對照組（什么都不加），雙氧水組（只加10 uM雙氧水），BDNF+雙氧水組，DMSO預(yù)處理液+雙氧水組，DMSO預(yù)處理液+Y1036+雙氧水組,P4預(yù)處理液+雙氧水組，P4預(yù)處理液+Y1036+雙氧水組。24 h后除對照組之外，其余都加入10uM雙氧水，放入CO2培養(yǎng)箱中。24h后用Hoechst33258染色，測定細胞凋亡率。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)方法 細胞培養(yǎng)液（250 mL）：DMEM/F12培養(yǎng)基225mL活性炭吸附的小牛血清或小牛血清37.5mL青霉素/鏈霉素2.5mL。

用含有FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)SH-SY5Y細胞24 h。24 h后，用PBS洗2次，用0.5mL胰蛋白酶快速洗1遍，在放入1mL胰蛋白酶，放入CO2培養(yǎng)箱中5Min。然后加入5 mL含有FBS的培養(yǎng)液，將細胞充分混勻后進行數(shù)細胞。用含C.S.FBS培養(yǎng)液和維甲酸以5×104/ML的密度將細胞鋪到12孔板中，分化1周。

將DMSO和10 nMP4加入到C6細胞中，處理24 h。然后提取上清液做為預(yù)處理溶液。

1.2.2 雙氧水誘導SH-SY5Y細胞凋亡的處理方法 應(yīng)用Hoechst染色，測定細胞凋亡率。按5×104/mL的密度將細胞鋪到6孔板中。分為3組：正常對照組，不加雙氧水；加入5 uM的雙氧水；加入10 uM的雙氧水。每組2個孔。24 h后，用Hoechst33258染色，測定細胞凋亡率。

1.2.3 P4對SH-SY5Y細胞凋亡的處理方法 把分化1周12孔板的SH-SY5Y細胞分為對照組（什么都不加），雙氧水組（只加10uM雙氧水），BDNF+雙氧水組，DMSO預(yù)處理液+雙氧水組，DMSO預(yù)處理液+Y1036+雙氧水組,P4預(yù)處理液+雙氧水組，P4預(yù)處理液+Y1p036+雙氧水組。將加入BDNF，DMSO預(yù)處理液，DMSO預(yù)處理液+Y1036，P4預(yù)處理液，P4預(yù)處理液+Y1036的細胞放入CO2培養(yǎng)箱中。24 h后除對照組之外，其余都加入10uM雙氧水，放入CO2培養(yǎng)箱中。24 h后用Hoechst33258染色，測定細胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計方法

該次研究相關(guān)數(shù)據(jù)采用Graphad PrisM5統(tǒng)計學軟件處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用F檢驗。

2 結(jié)果

2.1 雙氧水誘導SH-SY5Y細胞凋亡的濃度

正常對照組細胞呈橢圓或梭形，軸突明顯。隨著，雙氧水濃度增高，細胞損傷也隨之加重，胞膜破裂，細胞核固縮、凝聚和碎裂，見圖1。采用5uM的雙氧水處理SH-SY5Y細胞24 h后，凋亡率與正常對照組差異無統(tǒng)計學意義（P=0.6257>0.05）；用10 uM的雙氧水處理SH-SY5Y細胞24 h，凋亡率達到（56.33±13.17）%,與正常對照組差異有統(tǒng)計學意義（CF=5.950,P=0.0377<0.05），見圖2：圖中*符號表示響應(yīng)的兩組差異有統(tǒng)計學意義。所以，10 uM的雙氧水是誘導SH-SY5Y細胞凋亡的最佳濃度。

圖1 不同濃度雙氧水對SH-SY5Y細胞形態(tài)的影響

2.2 P4對SH-SY5Y細胞的保護作用

用10uM的雙氧水處理SH-SY5Y細胞24h后，經(jīng)Hoechst33258熒光染色，發(fā)現(xiàn)有亮藍色的典型凋亡細胞。加入P4-CM組凋亡細胞明顯減少，但是P4-CM+Y1036組凋亡的細胞有所增加，雙氧水組與P4-CM組差異有統(tǒng)計學意義（χ2=0.774 5，F(xiàn)=8.01 4,P=0.000 7<0.05，見圖3：*，@，#分別表示具有統(tǒng)計學意義的對照組），雙氧水組與P4+Y1036+雙氧水差異無統(tǒng)計學意義（P=0.082 5>0.05）。所以，P4對雙氧水誘導SH-SY5Y細胞凋亡有保護作用，且是通過增加BDNF釋放來起到保護作用的。

圖2 不同濃度雙氧水對SH-SY5Y細胞凋亡的影響

圖3 不同組合下SH-SY5Y細胞的保護作用的統(tǒng)計分析

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病一直被認為是頑固而難治的“三不”（病因不明，療效不好，預(yù)后不良）性疾病。研究證明，神經(jīng)細胞死亡的形式有：凋亡，壞死，自身吞噬，細胞質(zhì)增生。過氧化氫（H2O2）是體內(nèi)氧化代謝的中間產(chǎn)物，屬于非自由基活性氧，易穿透細胞膜，與細胞內(nèi)的還原型鐵離子通過Fenton反應(yīng)生成高度毒性的羥自由基，對多種細胞（特別是腦組織神經(jīng)元細胞）造成毒性，引起細胞死亡[7-9]。所以，本研究以H2O2作用于體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞，造成氧化損傷模型[10]。

本實驗首先應(yīng)用Hoechst33258熒光染色對H2O2誘導SH-SY5Y細胞的濃度進行檢測，結(jié)果表明，10uMH2O2處理細胞24 h后，凋亡率達到（58.33±13.17）%，5 uM的雙氧水處理細胞24 h后，凋亡率與正常對照組無統(tǒng)計學差異。所以選用10 uMH2O2誘導SH-SY5Y細胞凋亡[11-12]。給予H2O2之前，分別加入BDNF，DMSO預(yù)處理液，DMSO預(yù)處理液+Y1036，P4預(yù)處理液，P4預(yù)處理液+ Y1036。結(jié)果表明加入P4預(yù)處理液的細胞比加入DMSO預(yù)處理液的細胞，凋亡率明顯減少。加入Y1036組比沒加Y1036組細胞凋亡率有所增加。該實驗證明，P4通過增加BDNF的釋放對H2O2誘導SH-SY5Y細胞凋亡起到保護作用。下一步研究P4對小鼠海馬損傷是否有保護作用，該研究可能有益于中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療。

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The Protection of P4 on Hydrogen Peroxide Induced Apoptosis in SH-SY5Y Cells

JIN Xin1,YIN Yu-hong1,MATing2
1.Second Department of Neurology,JiamusiCentral Hospital,Jiamusi,Heilongjiang Province,154002 China；2.First Department of Neurology,Jiamusi Central Hospital,Jiamusi,Heilongjiang Province,154002 China

ObjectiveTo study the effects of P4 on hydrogen peroxide induced apoptosis in SH-SY5Y cells.MethodsModel of hydrogen peroxide induced apoptosis in SH-SY5Y cellswhich were cultured in vitro was built,for the intervention for which,P4 was used.The ratio of apoptosis determined by hoechst staining.ResultsApoptosis rate of SH-SY5Y cell was 56.33%±13.17% under 10uMhydrogen peroxide in 24 hours.However,after giving P4,SH-SY5Y cell apoptosis rate was significantly reduced. Therewere statistically significant differences between P4 plus hydrogen peroxide and hydrogen peroxide group(P<0.05).ConclusionP4 on apoptosis of SH-SY5Y cells have Aprotective effect.

P4;H2O2;SH-SY5Y cells;Hoechst33258 staining

R74

A

1674-0742（2015）06（b）－0045-03

2015-03-10）

金鑫（1979-），女，黑龍江佳木斯人,碩士，主治醫(yī)師，主要從事缺血性腦卒中的神經(jīng)保護作用機制方面的研究工作。

陰育紅（1971-），女，山東肥城人，碩士，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科工作。郵箱：xinjin620@163.com。