冠狀動脈內(nèi)干細(xì)胞灌注對載脂蛋白E基岡缺陷小鼠離體心臟血液動力學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)研究

鄭秀峰++趙石磊++楊力明

近年來，十細(xì)胞移植成為了國內(nèi)外臨床治療缺血性心臟病的熱點(diǎn)研究課題。冠狀動脈內(nèi)十細(xì)胞灌注具有操作簡單，能在進(jìn)行冠脈血運(yùn)重建時實(shí)施等優(yōu)點(diǎn)，受到了相關(guān)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。然而，冠脈內(nèi)十細(xì)胞注射是否會對受體心功能產(chǎn)生影響，以及最后留存于心臟中的細(xì)胞數(shù)量多少等問題都還未明確。為明確冠狀動脈內(nèi)十細(xì)胞灌注對缺血性心臟病心臟血液動力學(xué)的影響，該研究在2014年1月-2014年6月間對脂蛋白E（apo E）基因缺陷小鼠進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實(shí)驗(yàn)起止時間：2014年1月-2014年6月。實(shí)驗(yàn)動物：20只apoE小鼠、20只WT小鼠，雌雄各半。所有小鼠均經(jīng)腹腔注射60m/kg苯巴比妥鈉，麻醉后將小鼠心臟取出，放人10U/mL的肝素冰水灌注液中，并將主動脈與灌注管相連接。灌注細(xì)胞：小鼠胚胎十絀胞，在未分化狀態(tài)下，進(jìn)行細(xì)胞灌注前2d，開始經(jīng)貼壁培養(yǎng)，并在灌注當(dāng)天消化獲取。細(xì)胞活力經(jīng)鑒定>99.5%，之后配成l.Oxl0⁶細(xì)胞/5mL和2.5xl0⁶細(xì)胞/5mL的灌注液。灌注液：NaCl（120mmol/L）+NaHC0₃（25mmol/L）+KCl （4.7mmoI/L）+CaCl₂（2.5mmol/L）+M92S0₄（1.2mmoI/L）+KH₂P0₄（1.2mmol/L）+葡萄糖（15mmol/L）+EDTA（0.5mmol/L）+Pyruvate（2mmol/L）。灌注液酸堿度7.4，溫度37℃，同時補(bǔ)充5%的二氧化碳和95%的氧氣。

1.2 方法

分別取10只apo E小鼠的心臟作為低劑量組和高劑量組，低劑量組的十細(xì)胞灌注量為1.Oxl0⁶細(xì)胞，高劑量組的十細(xì)胞灌注量為2.5xl0⁶細(xì)胞。另外分別取10只WT小鼠的心臟分別作為低劑量對照組和高劑量對照組，低劑量對照組的十細(xì)胞灌注量為1.Oxl0⁶細(xì)胞，高劑量對照組的十細(xì)胞灌注量為2.5xl0⁶細(xì)胞。將左心房切開，置入測壓球囊達(dá)到二尖瓣口水平，并將基礎(chǔ)壓力調(diào)整至10mmHg，然后開始進(jìn)行絀胞灌注。排除5min內(nèi)出現(xiàn)冠脈血流大于5mUmin者，收縮壓低于100mmHg者，心率低于320次/min及嚴(yán)重心律失常者。

1.3 觀察指標(biāo)

比較離體心臟各時刻（T0：5min穩(wěn)定后；Tl：灌注完成即刻；T2：灌注后5min；T3：灌注后15min；T4：灌注后30min）的血流動力學(xué)指標(biāo)：LVPP（左心室最大壓力）、心率、+dp/dt（左心室等容收縮期壓力最大變化速率）、-dp/dt（左心室等容舒張期壓力最大變化速率）、LVEDP（左心室舒張末壓）。并觀察各組的冠脈流量、漏出液中的細(xì)胞含量。5min穩(wěn)定后。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

該次研究數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料以率%表示，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)比較分別采用X2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心率變化

各組的心率變化比較見表1。從表1可知，四組T1～T4時刻的心率均顯著低于TO時刻差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；且高劑量組的心率變化最明顯，低劑量組其次，高劑量對照組第三，低劑量對照組的心率變化最小。

2.3 +dp/dt和-dp/dt變化

四組的+dp/dt和-dp/dt變化分別見圖2和圖3。從圖2、3可知，細(xì)胞灌注后，四組的+dp/dt和-dp/dt水平均顯著降低，且以高劑量組的下降幅度最為明顯。

2.4 冠脈流量、漏出液細(xì)胞含量

細(xì)胞灌注后，四組的冠脈流量均較灌注前顯著降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；且以高劑量組的降低幅度最明顯，與其他三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。灌注后30min，四組的漏出

3 討論

目前，初期臨床研究和動物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了細(xì)胞替代治療心血管疾病尤其是缺血性心力衰竭的安全性和可行性。分析近期大量研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，關(guān)于成體十細(xì)胞治療心血管疾病的近30項(xiàng)研究中，僅有4項(xiàng)研究得出的結(jié)論有益于該治療方法，關(guān)于移植急性期對心臟血流動力學(xué)的影響，以及細(xì)胞移植確切療效等問題的研究仍未得到有效解決。

在該次研究中，針對心血管疾病的冠脈十細(xì)胞移植療法，利用Langendorff體外灌注模型，模擬了冠脈十細(xì)胞移植治療方法，用以觀察其對心臟血流動力學(xué)指標(biāo)的影響。該次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：四組Tl～T4時刻的心率均顯著低于TO時刻差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且高劑量組的心率變化最明顯從TO時刻的（347.6+29.7）次/min降至T4時刻的（245.4+40.9）次/min；并且四組在進(jìn)行細(xì)胞灌注后，LVEDP水平均顯著升高，+dp/dt和-dp/dt水平均顯著降低，且均以高劑量組的上升或下降幅度最為顯著。這提示冠脈十細(xì)胞灌注會對LVPP、心率、+dp/dt、-dp/dt、冠脈流量、LVEDP等心臟血流動力學(xué)指標(biāo)產(chǎn)生不利影響，且灌注劑量越高，影響越明顯。

apoE缺陷小鼠會因膽固醇代謝障礙而發(fā)生高膽固醇血癥，同時還會發(fā)生全身動脈血管粥樣硬化。而臨床研究已證實(shí)冠心病心肌梗死的基礎(chǔ)病因就是冠狀動脈粥樣硬化，冠心病心肌梗死患者的病理變化與apoE缺陷小鼠冠脈病理變化類似，故該次實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠?yàn)榕R床研究冠脈內(nèi)十細(xì)胞灌注治療冠心病心肌梗死提供一定的參考、借鑒。一直以來，冠脈細(xì)胞移植灌注可能引起冠脈微循環(huán)栓塞都是臨床應(yīng)用冠脈內(nèi)十細(xì)胞灌注治療冠心病的一大顧慮。國外有動物實(shí)驗(yàn)研究顯示，冠脈抑制白體骨髓MSC（間充質(zhì)十細(xì)胞）會引起冠脈微循環(huán)栓塞。在該次研究中，結(jié)果也顯示十細(xì)胞灌注后，冠脈血流量明顯降低，尤其是高劑量組小鼠的冠脈血流量降低更為顯著。推測這可能是因?yàn)楣诿}微循環(huán)受累所致。十細(xì)胞移植的細(xì)胞大小、細(xì)胞類型都會對冠脈微循環(huán)栓塞的形成產(chǎn)生不同的影響。國外有實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用了培養(yǎng)后的字體骨髓MSC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此類細(xì)胞存在較為明顯的安全性問題。在該次研究中，應(yīng)用了胚胎十細(xì)胞，該細(xì)胞的體積類似于未培養(yǎng)的骨髓單核細(xì)胞，雖然尚無文獻(xiàn)報(bào)道未培養(yǎng)骨髓十細(xì)胞會引起微循環(huán)栓塞，但不少臨床研究都未連續(xù)監(jiān)測細(xì)胞移植后的心肌酶譜變化，故冠脈細(xì)胞移植是否會對冠脈微循環(huán)產(chǎn)生影響仍有待進(jìn)一步考證。

綜上所述，冠脈內(nèi)十細(xì)胞灌注會對載脂蛋白E基因缺陷小鼠離體心臟的血流動力學(xué)產(chǎn)生不良影響，并且灌注劑量越大，不良影響越顯著。