冠狀動脈內(nèi)干細(xì)胞灌注對載脂蛋白E基因缺陷小鼠離體心臟血液動力學(xué)影響的實驗研究

鄭秀峰，趙石磊，楊力明

1.黑龍江省醫(yī)院心內(nèi)科，黑龍江哈爾濱 150036；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，黑龍江哈爾濱 150001；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，黑龍江哈爾濱 150001

冠狀動脈內(nèi)干細(xì)胞灌注對載脂蛋白E基因缺陷小鼠離體心臟血液動力學(xué)影響的實驗研究

鄭秀峰1，趙石磊2，楊力明3

1.黑龍江省醫(yī)院心內(nèi)科，黑龍江哈爾濱 150036；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，黑龍江哈爾濱 150001；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，黑龍江哈爾濱 150001

目的探討冠狀動脈內(nèi)干細(xì)胞灌注對載脂蛋白E基因缺陷小鼠離體心臟血液動力學(xué)的影響。方法設(shè)計Langendorff離體心臟灌注模型，比較接受低劑量（1.0×106）、高劑量（2.5×106）干細(xì)胞灌注時及灌注后5min、15min、30min兩組載脂蛋白E基因缺陷小鼠（低劑量組、高劑量組）和兩組WT小鼠心臟（低劑量對照組、高劑量對照組）的血流動力學(xué)指標(biāo)。同時比較注射后5min、15min、30min時，兩組心臟細(xì)胞的血流動力學(xué)指標(biāo)。結(jié)果四組T1~T4時刻的心率均顯著低于T0時刻差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；且高劑量組的心率變化最明顯。四組在進(jìn)行細(xì)胞灌注后，LVEDP水平均顯著升高，+dp/dt和-dp/dt水平均顯著降低，且均以高劑量組的上升或下降幅度最為顯著。細(xì)胞灌注后，四組的冠脈流量均較灌注前顯著降低差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；且以高劑量組的降低幅度最明顯，與其他三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。灌注后30min，四組的漏出液細(xì)胞含量均達(dá)到了60%以上。結(jié)論冠脈內(nèi)干細(xì)胞灌注會對載脂蛋白E基因缺陷小鼠離體心臟的血流動力學(xué)產(chǎn)生不良影響，并且灌注劑量越大，不良影響越顯著。

血流動力學(xué)；載脂蛋白E基因缺陷；干細(xì)胞灌注；冠狀動脈

近年來，干細(xì)胞移植成為了國內(nèi)外臨床治療缺血性心臟病的熱點研究課題。冠狀動脈內(nèi)干細(xì)胞灌注具有操作簡單，能在進(jìn)行冠脈血運重建時實施等優(yōu)點，受到了相關(guān)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[1]。然而，冠脈內(nèi)干細(xì)胞注射是否會對受體心功能產(chǎn)生影響，以及最后留存于心臟中的細(xì)胞數(shù)量多少等問題都還未明確[2]。為明確冠狀動脈內(nèi)干細(xì)胞灌注對缺血性心臟病心臟血液動力學(xué)的影響，該研究在2014年1月—2014年6月間對脂蛋白E（apo E）基因缺陷小鼠進(jìn)行了實驗研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實驗起止時間：2014年1月—2014年6月。實驗動物：20只apo E小鼠、20只WT小鼠，雌雄各半。所有小鼠均經(jīng)腹腔注射60mg/kg苯巴比妥鈉，麻醉后將小鼠心臟取出，放入10 U/ML的肝素冰水灌注液中，并將主動脈與灌注管相連接。灌注細(xì)胞：小鼠胚胎干細(xì)胞，在未分化狀態(tài)下，進(jìn)行細(xì)胞灌注前2 d，開始經(jīng)貼壁培養(yǎng)，并在灌注當(dāng)天消化獲取。細(xì)胞活力經(jīng)鑒定＞99.5%，之后配成1.0×106細(xì)胞/5mL和2.5×106細(xì)胞/5mL的灌注液。灌注液：NaCl（120mmol/L）+NaHCO3（25 mmol/L）+KCl（4.7 mmol/L）+CaCl2（2.5 mmol/L）+ Mg2SO4（1.2 mmol/L）+KH2PO4（1.2 mmol/L）+葡萄糖（15 mmol/L）+ EDTA（0.5mmol/L）+Pyruvate（2mmol/L）。灌注液酸堿度7.4，溫度37℃，同時補(bǔ)充5%的二氧化碳和95%的氧氣。

1.2 方法

分別取10只apo E小鼠的心臟作為低劑量組和高劑量組，低劑量組的干細(xì)胞灌注量為1.0×106細(xì)胞，高劑量組的干細(xì)胞灌注量為2.5×106細(xì)胞。另外分別取10只WT小鼠的心臟分別作為低劑量對照組和高劑量對照組，低劑量對照組的干細(xì)胞灌注量為1.0×106細(xì)胞，高劑量對照組的干細(xì)胞灌注量為2.5×106細(xì)胞。將左心房切開，置入測壓球囊達(dá)到二尖瓣口水平，并將基礎(chǔ)壓力調(diào)整至10mmHg，然后開始進(jìn)行細(xì)胞灌注。排除5min內(nèi)出現(xiàn)冠脈血流大于5mL/min者，收縮壓低于100mmHg者，心率低于320次/min及嚴(yán)重心律失常者。

1.3 觀察指標(biāo)

比較離體心臟各時刻（T0：5 min穩(wěn)定后；T1：灌注完成即刻；T2：灌注后5min；T3：灌注后15min；T4：灌注后30 min）的血流動力學(xué)指標(biāo)：LVPP（左心室最大壓力）、心率、+dp/dt（左心室等容收縮期壓力最大變化速率）、-dp/dt（左心室等容舒張期壓力最大變化速率）、LVEDP（左心室舒張末壓）。并觀察各組的冠脈流量、漏出液中的細(xì)胞含量。5min穩(wěn)定后。

1.4 統(tǒng)計方法

該次研究數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理，計數(shù)資料以率%表示，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)比較分別采用χ2檢驗和t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心率變化

各組的心率變化比較見表1。從表1可知，四組T1~T4時刻的心率均顯著低于T0時刻差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；且高劑量組的心率變化最明顯，低劑量組其次，高劑量對照組第三，低劑量對照組的心率變化最小。

2.2 LVEDP變化

四組的LVEDP變化見圖1。從圖1可知，四組在進(jìn)行細(xì)胞灌注后，LVEDP水平均顯著升高，且以高劑量組的上升幅度最為顯著。

圖1 四組的LVEDP變化

2.3 +dp/dt和-dp/dt變化

四組的+dp/dt和-dp/dt變化分別見圖2和圖3。從圖2、3可知，細(xì)胞灌注后，四組的+dp/dt和-dp/dt水平均顯著降低，且以高劑量組的下降幅度最為明顯。

2.4 冠脈流量、漏出液細(xì)胞含量

細(xì)胞灌注后，四組的冠脈流量均較灌注前顯著降低差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；且以高劑量組的降低幅度最明顯，與其他三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。灌注后30 min，四組的漏出液細(xì)胞含量均達(dá)到了60%以上。見表2。

圖2 四組的+dp/dt變化

圖3 四組的-dp/dt水平變化

表2 四組灌注前后的冠脈流量及漏出液細(xì)胞含量比較（x±s）

3 討論

目前，初期臨床研究和動物實驗均證實了細(xì)胞替代治療心血管疾病尤其是缺血性心力衰竭的安全性和可行性[3]。分析近期大量研究報道發(fā)現(xiàn)，關(guān)于成體干細(xì)胞治療心血管疾病的近30項研究中，僅有4項研究得出的結(jié)論有益于該治療方法，關(guān)于移植急性期對心臟血流動力學(xué)的影響，以及細(xì)胞移植確切療效等問題的研究仍未得到有效解決[4]。

在該次研究中，針對心血管疾病的冠脈干細(xì)胞移植療法，利用Langendorff體外灌注模型，模擬了冠脈干細(xì)胞移植治療方法，用以觀察其對心臟血流動力學(xué)指標(biāo)的影響。該次實驗結(jié)果顯示：四組T1~T4時刻的心率均顯著低于T0時刻差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且高劑量組的心率變化最明顯從T0時刻的 （347.6± 29.7）次/min降至T4時刻的（245.4±40.9）次/min；并且四組在進(jìn)行細(xì)胞灌注后，LVEDP水平均顯著升高，+dp/dt和-dp/dt水平均顯著降低，且均以高劑量組的上升或下降幅度最為顯著。這提示冠脈干細(xì)胞灌注會對LVPP、心率、+dp/dt、-dp/dt、冠脈流量、LVEDP等心臟血流動力學(xué)指標(biāo)產(chǎn)生不利影響，且灌注劑量越高，影響越明顯。

apo E缺陷小鼠會因膽固醇代謝障礙而發(fā)生高膽固醇血癥，同時還會發(fā)生全身動脈血管粥樣硬化。而臨床研究已證實冠心病心肌梗死的基礎(chǔ)病因就是冠狀動脈粥樣硬化，冠心病心肌梗死患者的病理變化與apo E缺陷小鼠冠脈病理變化類似，故該次實驗結(jié)果能夠為臨床研究冠脈內(nèi)干細(xì)胞灌注治療冠心病心肌梗死提供一定的參考、借鑒。一直以來，冠脈細(xì)胞移植灌注可能引起冠脈微循環(huán)栓塞都是臨床應(yīng)用冠脈內(nèi)干細(xì)胞灌注治療冠心病的一大顧慮。國外有動物實驗研究[5]顯示，冠脈抑制自體骨髓MSC（間充質(zhì)干細(xì)胞）會引起冠脈微循環(huán)栓塞。在該次研究中，結(jié)果也顯示干細(xì)胞灌注后，冠脈血流量明顯降低，尤其是高劑量組小鼠的冠脈血流量降低更為顯著。推測這可能是因為冠脈微循環(huán)受累所致。干細(xì)胞移植的細(xì)胞大小、細(xì)胞類型都會對冠脈微循環(huán)栓塞的形成產(chǎn)生不同的影響。國外有實驗研究應(yīng)用了培養(yǎng)后的字體骨髓MSC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此類細(xì)胞存在較為明顯的安全性問題[6]。在該次研究中，應(yīng)用了胚胎干細(xì)胞，該細(xì)胞的體積類似于未培養(yǎng)的骨髓單核細(xì)胞，雖然尚無文獻(xiàn)報道未培養(yǎng)骨髓干細(xì)胞會引起微循環(huán)栓塞，但不少臨床研究都未連續(xù)監(jiān)測細(xì)胞移植后的心肌酶譜變化，故冠脈細(xì)胞移植是否會對冠脈微循環(huán)產(chǎn)生影響仍有待進(jìn)一步考證。

綜上所述，冠脈內(nèi)干細(xì)胞灌注會對載脂蛋白E基因缺陷小鼠離體心臟的血流動力學(xué)產(chǎn)生不良影響，并且灌注劑量越大，不良影響越顯著。

[1]羅罕,李安杰,周永剛，等.超選擇性冠狀動脈內(nèi)臍血干細(xì)胞移植治療冠心病的初步研究[J].貴州醫(yī)藥,2013,37(3):206-208.

[2]王世宏,崔俊玉,路敏，等.冠狀動脈自體骨髓CD34+干細(xì)胞移植治療心絞痛:隨機(jī)對照臨床分析[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13 (14):2623-2626.

[3]尹作民,李長江,王燕，等.冠狀動脈內(nèi)注射自體骨髓干細(xì)胞改善急性心肌梗死患者的心功能[J].中國醫(yī)藥,2010,5(9):785-787.

[4]韋艷.干細(xì)胞修復(fù)缺血性心肌損傷研究進(jìn)展[J].海南醫(yī)學(xué),2012,23(8): 119-122.

[5]肖文濤,高麗君,高傳玉，等.不同類型骨髓干細(xì)胞移植治療擴(kuò)張型心肌病的療效對比[J].中華心血管病雜志,2012,40(7):575-578.

[6]肖文濤,高傳玉,戴國友，等.自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)無功能心肌的對比[J].中國組織工程研究,2012,16(27):5081-5086.

Experimental Study of the Effect of Intracoronary SteMCell Infusion on the Isolated Heart HeModynaMics in Mice with Apolipoprotein E Gene Defect

ZHENG Xiu-feng1，ZHAO Shi-lei2，YANG Li-Ming3
1.Cardiovascular Department,Heilongjiang Provincial Hospital,Harbin,Heilongjiang Province,150036 China;2.Nephrology Department,The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin,Heilongjiang Province 150001,China;3.Department of Pathophysiology,Harbin Medical University,Harbin,Heilongjiang Province,150001 China

Ob jectiveTo investigate the effectof intracoronary steMcell infusion on the isolated hearthemodynamics inmice with apolipoprotein E gene defect.MethodsLangendorff isolated heart perfusion model was set up.The mice with apolipoprotein E gene defectwere equally divided into low-dose group [steMcells perfusion (1.0×106)]and high-dose group[steMcells perfusion (2.5×106)],and the same amount ofWTmice were equally divided into low-dose control group[steMcells perfusion(1.0×106)]and high-dose control group[steMcells perfusion(2.5×106)].The heart hemodynamics was compared between the groups at the time of perfusion,5Min,15min,and 30Min after perfusion.And the heart cells hemodynamics were compared between the groups 5min, 15min,and 30min after injection.Resu ltsThe heart rate of the four groups wasmuch lower at T1~T4 than at T0(P<0.05);and the heart rate of high-dose group changed most significantly.After perfusion of steMcells,the levels of LVEDP increased obviously while levels of+dp/dt and-dp/dt decreased significantly in the four groups,and the high-dose group had the biggest increase or decline.Compared with before perfusion of steMcells,after perfusion,the coronary blood flow in the four groups decreased significantly,P<0.05,and the high-dose group had the biggest decline compared with the other three groups(P<0.05).30min after perfusion,the proportion of cells in transudate reached more than 60%in all the four groups.ConclusionThe intracoronary infusion of steMcells adversely affected the heart hemodynamics in mice with apolipoprotein E gene defect,and the greater the infusion dose was,themore significant adverse effectswere.

Hemodynamics;Apolipoprotein E gene defect;SteMcell infusion;Coronary artery

R687.3

A

1674-0742（2015）06（b）－0006-03

2015-03-18）

鄭秀峰（1982-），男，黑龍江哈爾濱人，碩士在讀，主治醫(yī)師，主要從事心血管病方面的工作。

楊力明（1978-），男，黑龍江五常人，博士后，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室。