先天性心臟病相關(guān)PITX2c基因新突變研究

潘 云 周 寧 趙 紅 鄭桂芬 劉興元

先天性心臟病 （congenital heart disease，CHD） 是嬰幼兒非感染性死亡的最常見(jiàn)病因［1］。根據(jù)解剖結(jié)構(gòu)差異，CHD在臨床上可以分為20種以上不同的類(lèi)型，其中以室間隔缺損（ventricular septal defect，VSD）最為常見(jiàn)［1］。嚴(yán)重的CHD可以降低患者的生活質(zhì)量和運(yùn)動(dòng)耐力，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷、肺動(dòng)脈高壓、充血性心力衰竭、心律失常甚至心源性猝死等［1－3］。遺傳因素是CHD發(fā)生的重要原因，現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了50多個(gè)CHD相關(guān)基因［4－6］。盡管如此，這些CHD相關(guān)基因也只能解釋小部分患者的病因，大部分患者的遺傳基礎(chǔ)依然不明。研究發(fā)現(xiàn)，心臟轉(zhuǎn)錄因子基因PITX2c對(duì)心臟的正常發(fā)育具有關(guān)鍵作用［7］。在小鼠，PITX2c基因敲除可導(dǎo)致胚胎期死亡，主要是由各種心血管發(fā)育缺陷所致，包括心房畸形、房間隔缺損、VSD、右心室雙流出道、大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位和主動(dòng)脈弓異常［8］。因此，PITX2c基因可以作為CHD的重要候選基因。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

150例無(wú)血緣關(guān)系的中國(guó)漢族CHD患兒為CHD組，男82例，女68例，年齡0～3歲，平均1歲。200名無(wú)血緣關(guān)系的種族匹配的健康幼兒為對(duì)照組，男120名，女80名，年齡0～3歲，平均1歲。詳細(xì)詢問(wèn)病史、全面體檢以及經(jīng)胸心臟超聲和12導(dǎo)聯(lián)標(biāo)準(zhǔn)心電圖檢查，排除綜合征型CHD患者。經(jīng)患兒父母知情同意后抽取外周靜脈血1～2 mL，于抗凝管中混勻后－20℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 分離基因組DNA 使用購(gòu)買(mǎi)的基因組DNA純化試劑盒（美國(guó)Promega公司），遵照操作說(shuō)明書(shū)從研究對(duì)象的血白細(xì)胞中提取基因組DNA。1.2.2 擴(kuò)增PITX2c基因 使用文獻(xiàn)報(bào)道的6對(duì)引物［9］，以研究對(duì)象的基因組DNA為模板，應(yīng)用Hot Star Taq DNA聚合酶等聚合酶鏈反應(yīng)（poly merase chain reaction，PCR）試 劑 （德 國(guó)Qiagen公司），在PE9700型PCR儀（美國(guó)Applied Biosystem公司）上擴(kuò)增PITX2c基因片段。使用凝膠回收試劑盒（中國(guó)生工生物工程公司）純化擴(kuò)增的目的DNA片段。

1.2.3 PITX2c基因突變掃描 以純化的目的DNA片段為模板，在PCR儀上進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。利用3130 XL型DNA分析儀（美國(guó)Applied Biosystem公司）對(duì)每一純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳測(cè)序，并將所測(cè)序列與Gen Bank中的已知PITX2c序列（登陸號(hào)：NM＿000325.5）進(jìn)行對(duì)比，以發(fā)現(xiàn)可能的PITX2c基因突變。對(duì)于所發(fā)現(xiàn)的PITX2c基因突變，檢索我國(guó)的萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／www．wanfangdata．com．cn），以及美國(guó)的 Pub Med 和SNP數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／www．ncbi．nl m．nih．gov），以明確其是否為新發(fā)現(xiàn)突變。

1.2.4 分析突變位點(diǎn)氨基酸在進(jìn)化上的保守性 使用3.6版本的在線軟件 MUSCLE（http：／／www．ncbi．nl m．nih．gov），比較多物種PITX2c蛋白的氨基酸序列，以明確突變位點(diǎn)氨基酸在進(jìn)化上的保守性。1.2.5 預(yù)測(cè)PITX2c基因突變的致病性 使用在線程 序 Mutation Taster（http：／／www．mutationtaster．org）和 Poly Phen-2（http：／／genetics．bwh．harvard．edu／pph2／），對(duì)所檢測(cè)出的PITX2c基因變異的致病性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并給出相應(yīng)的預(yù)測(cè)分析量值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示連續(xù)變量。使用非配對(duì)Student′s t檢驗(yàn)對(duì)兩組連續(xù)變量進(jìn)行比較，而兩組分類(lèi)變量的比較則使用Pearson′sχ2檢驗(yàn)。以雙側(cè)P＜0．05為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)現(xiàn)新的PITX2c基因雜合錯(cuò)義突變

通過(guò)基因測(cè)序分析，在1例CHD患兒中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)PITX2c雜合錯(cuò)義突變，突變率約為0.67%。該例半歲男嬰為散發(fā)性VSD患兒，其PITX2c基因第101密碼子的第一個(gè)核苷酸腺嘌呤（adenine，A）被鳥(niǎo)嘌呤（guanine，G）所替換，即c.301 A＞G突變，意味著其PITX2c基因編碼氨基酸序列第101位的絲氨酸（serine，S）變成了甘氨酸（gl ycine，G），即p．S101G突變。經(jīng)檢索，該P(yáng)ITX2c突變此前尚無(wú)報(bào)道，提示為新發(fā)現(xiàn)的突變。PITX2c基因c.301 A＞G雜合突變及其正常對(duì)照DNA序列見(jiàn)圖1。

2.2 被改變的氨基酸在進(jìn)化上完全保守

將人PITX2c蛋白之氨基酸序列與猩猩、猴、犬、牛、小鼠、大鼠、禽、斑馬魚(yú)、果蠅、蚊子和蟾蜍的進(jìn)行比對(duì)顯示，第101位的絲氨酸在進(jìn)化上完全保守，提示該氨基酸對(duì)PITX2c的功能具有重要作用（見(jiàn)圖2）。

2.3 此PITX2c基因變異為致病性突變

Mutation Taste預(yù)測(cè)分析表明，本研究所發(fā)現(xiàn)的PITX2c基因變異c.301 A＞G是一個(gè)致病性突變，這一預(yù)測(cè)結(jié)果正確的概率值高達(dá)99.9%。在Mutation Taster數(shù)據(jù)庫(kù)中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PITX2c基因之c.301 A＞G變異，進(jìn)一步證實(shí)該P(yáng)ITX2c基因變異是新突變。此外，Pol y Phen-2也預(yù)測(cè)PITX2c基因變異p．S101G具有致病性，其預(yù)測(cè)正確的概率為99.6%，這一預(yù)測(cè)的敏感性是36%，特異性是97%。

圖1 PITX2c基因c.301A＞G雜合突變及其正常對(duì)照序列

圖2 多物種PITX2c蛋白的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

3 討論

PITX2是成對(duì)樣同源盒轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有4種不同的轉(zhuǎn)錄本，分別為PITX2a、PITX2b、PITX2c和PITX2d，其中前3種僅是氨基端不同，存在于人、鼠、禽、斑馬魚(yú)和蛙，而第4種則缺少整個(gè)氨基端連同大部分同源盒結(jié)構(gòu)域，僅存在于人類(lèi)［10］。人類(lèi)PITX2c基因定位于染色體4q25，編碼含324個(gè)氨基酸所組成的蛋白［11］。PITX2c蛋白主要表達(dá)于胚胎期和成年心臟，是心血管正常發(fā)育所必須的［12］。在小鼠，PITX2c蛋白特異性地表達(dá)于小梁和間隔心肌，尤其是與房室通道和流出道的心內(nèi)膜墊有關(guān)的心肌，對(duì)心臟間隔形成起著關(guān)鍵作用［13］。PITX2c基因敲除小鼠可因各種心血管發(fā)育畸形而死亡，主要有心房畸形、房間隔缺損、VSD、右心室雙流出道、大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位和主動(dòng)脈弓異常［8］。利用化學(xué)修飾的反義寡核苷酸敲除蟾蜍PITX2c基因可導(dǎo)致心臟發(fā)育障礙，其中最常見(jiàn)的畸形是流出道異常，可發(fā)生于23%的注射過(guò)PITX2c基因反義寡核苷酸的蟾蜍胚胎。PITX2c基因靶向RNA干擾所導(dǎo)致的其他心臟畸形包括房間隔異常、心室發(fā)育抑制和房室腔相對(duì)位置異常等［14］。這些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，發(fā)育中的心血管系統(tǒng)對(duì)PITX2c基因的表達(dá)水平極其敏感，PITX2c基因功能異?？蓪?dǎo)致CHD。

本研究在1例散發(fā)性VSD患兒檢測(cè)出了1個(gè)新的PITX2c基因雜合錯(cuò)義突變，即p．S101 G突變。該突變?cè)?00名無(wú)CHD的對(duì)照者基因組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)?？缥锓NPITX2c蛋白的氨基酸序列比對(duì)顯示，人PITX2c蛋白第101位的絲氨酸在進(jìn)化上完全保守，計(jì)算機(jī)功能模擬分析表明所發(fā)現(xiàn)的PITX2c基因變異是致病性突變。因此，PITX2c基因缺陷很有可能導(dǎo)致該例患者發(fā)生VSD。

PITX2c基因變異與人類(lèi)CHD的關(guān)系以前也有報(bào)道。Yuan等［15］對(duì)150例無(wú)血緣關(guān)系的CHD患者的PITX2c基因的編碼外顯子及其兩側(cè)的部分內(nèi)含子進(jìn)行了測(cè)序分析，結(jié)果在其中2例散發(fā)性房間隔缺損患者分別發(fā)現(xiàn)了p．H98 Q和p．M119T突變，突變率約為1.33%。報(bào)告基因分析顯示，這兩種突變型PITX2c基因的轉(zhuǎn)錄活性均顯著降低。Wang等［16］對(duì)382例無(wú)血緣關(guān)系的CHD患者的PITX2c基因進(jìn)行了測(cè)序分析，結(jié)果在其中1例家族史陰性的右室雙流出道合并VSD患者發(fā)現(xiàn)p．W147X突變；在另1例家族史陽(yáng)性的VSD患者發(fā)現(xiàn)p．N153D突變，突變率約為0.52%。生化分析顯示，這兩種突變型PITX2c對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活作用顯著下降。另外，Wei等［17］對(duì)170例無(wú)血緣關(guān)系的CHD患兒的PITX2c基因的整個(gè)編碼區(qū)和剪接位點(diǎn)進(jìn)行了測(cè)序分析，結(jié)果在其中2例大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位合并VSD患兒分別發(fā)現(xiàn)了p．R91 Q和p．T129S突變，突變率約為1.18%。功能研究表明，這兩種突變均顯著降低PITX2c對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活作用。這些研究發(fā)現(xiàn)提示，PITX2c基因功能缺失性突變可能是導(dǎo)致部分CHD的分子機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)了CHD相關(guān)新的PITX2c基因突變，擴(kuò)大了CHD相關(guān)PITX2c基因的突變譜，有助于制定新的CHD防治策略。

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