糖毒性對心肌細胞損傷的研究初探

王庸晉 劉 暢 曹文君 郭 穎 李 丹 趙婷婷

糖尿病性心肌病（diabetic cardio myopathy，DCM）是糖尿病的慢性并發(fā)癥之一，可導致糖尿病患者發(fā)生心力衰竭，也是其晚期致死的主要原因，嚴重影響患者的生活質量［1－2］。與健康人群相比，糖尿病患者更易患高血壓、心力衰竭及冠狀動脈疾病，因此防治心血管疾病并發(fā)癥已成為治療糖尿病的關鍵［3］。糖尿病對心臟損害的研究目前主要局限于其對動脈粥樣硬化、冠心病等的影響，而對于心肌細胞損傷的報道較少。本研究以體外培養(yǎng)的H9C2心肌細胞為模型，觀察不同葡萄糖濃度下心肌細胞形態(tài)、存活及凋亡情況，旨在初步探討糖毒性對心肌細胞的損傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠心肌細胞系H9C2，購自中國科學院上海生命科學研究院。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 在37℃、5%CO2條件下，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠心肌細胞H9C2，2 d后換液。培養(yǎng)至細胞融合達80%，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，培養(yǎng)6～7代后進行實驗。至細胞呈對數(shù)生長期，調整細胞數(shù)目為1×106／mL，將其接種于6孔板中進一步培養(yǎng)，待細胞生長至融合狀態(tài)，用無血清培養(yǎng)基饑餓處理24 h，使細胞處于靜止狀態(tài)。

1.2.2 實驗分組 加入不同濃度葡萄糖溶液，分為4組：5 mmol／L 葡萄糖組、15 mmol／L 葡萄糖、45 mmol／L葡萄糖組、空白對照組。

1.2.3 MTT法檢測細胞存活率 將H9C2心肌細胞密度調整至2×104／孔左右，接種于96孔培養(yǎng)板中，各孔加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液，加入無血清培養(yǎng)基饑餓處理6 h，使細胞同步。各組加入不同濃度葡萄糖，每組設6個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。每孔加入50μL新鮮MTT（5 mg／mL），于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入200μL DMSO，37℃輕搖10 min，將紫色結晶溶解。之后用酶標儀于490 nm波長下測定吸光度。

圖1 H 9 C2心肌細胞在不同濃度葡萄糖作用下培養(yǎng)24 h的形態(tài)

1.2.4 流式細胞分析儀檢測H9C2細胞凋亡率 用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細胞，終止消化后收集各組細胞，800轉／min，5 min離心棄上清，加PBS重懸細胞，該步驟重復2次，將細胞數(shù)目調整為1×106／mL左右。按照試劑盒說明，用染色緩沖液重懸細胞，之后加入5μL PI染色液，混勻后室溫避光孵育15 min。最后用PBS洗滌細胞1次，流式細胞儀上機檢測結果，并用流式二維圖計算早期細胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17．0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義；以P＜0．01為有顯著差異。

2 結果

2.1 不同濃度葡萄糖作用下心肌細胞形態(tài)學變化

正常心肌細胞呈橢圓形或長梭形，經傳代培養(yǎng)后，心肌細胞生長融合，形態(tài)不變。在5 mmol／L葡萄糖作用下，心肌細胞形態(tài)無明顯變化；在15 mmol／L葡萄糖作用下，心肌細胞胞體開始皺縮；在15 mmol／L葡萄糖作用下，心肌細胞胞體開始皺縮；在45 mmol／L葡萄糖作用下，心肌細胞胞體變圓、縮小，脫落不貼壁（見圖1）。

2.2 不同濃度葡萄糖對H 9 C2心肌細胞存活率的影響

H9C2心肌細胞經5 mmol／L 、15 mmol／L葡萄糖刺激24 h后，其存活率與對照組相比差異不顯著。用5、15和45 mmol／L葡萄糖處理48 h和72 h后，細胞存活率與24 h相比降低。隨著葡萄糖濃度和刺激時間的增加，細胞存活率逐漸降低（見表1）。45 mmol／L葡萄糖刺激48 h后細胞存活率降至（45．09±0.84）%；該濃度下刺激72 h后細胞存活率進一步降至（37.93±0.66）%。

表1 各實驗組H9 C2心肌細胞存活率的比較

2.3 流式細胞儀分析凋亡率

心肌細胞在不同葡萄糖濃度下培養(yǎng)24 h，細胞 凋亡率隨葡萄糖濃度升高而明顯增加（見圖2）。

圖2 不同濃度葡萄糖作用下H 9 C2心肌細胞培養(yǎng)24 h的凋亡率

3 討論

1972年，Rubler等［4］將糖尿病患者除外高血壓、動脈粥樣硬化、心臟瓣膜病等可能性的特異性心肌病定義為DCM。DCM會引起心肌細胞代謝紊亂、微血管病變等。DCM患者在早期無明顯癥狀，后期可出現(xiàn)心律失常、心功能不全等。研究發(fā)現(xiàn)，活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）產生量的嚴重失衡所引發(fā)的氧化應激狀態(tài)與DCM的發(fā)生有關，同時機體抗氧化保護系統(tǒng)的清除能力也影響DCM的發(fā)生、發(fā)展［5］。DCM目前尚缺乏統(tǒng)一診斷標準。國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2011年全球糖尿病患者已達3.66億，預計20年后患病人數(shù)將上升至5.52億［6］。

高糖處理心肌細胞可致氧自由基增加，脂質等生物大分子發(fā)生過氧化反應，細胞結構和功能發(fā)生改變，引起心肌細胞舒張期延長、收縮功能下降［7］。本實驗以體外培養(yǎng)的大鼠心肌細胞系H9C2為模型，觀察不同葡萄糖濃度下心肌細胞的形態(tài)學變化，并通過MTT實驗和流式細胞儀檢測H9C2細胞存活率和凋亡率。結果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)24 h后H9C2細胞形態(tài)開始發(fā)生變化，胞體變圓、縮小，脫落不貼壁；培養(yǎng)48 h后H9C2細胞存活率明顯下降、凋亡率上升，且上述效應呈葡萄糖濃度依賴性。心肌細胞凋亡是DCM主要發(fā)生機制，減輕高糖誘導的心肌細胞凋亡能預防多種糖尿病并發(fā)癥［8］。隨著葡萄糖濃度升高和作用時間延長，心肌細胞凋亡更為明顯。用15 mmol／L和45 mmol／L葡萄糖處理心肌細胞48 h以上，細胞存活率與對照組相比均顯著下降。提示高糖對心肌細胞有直接損傷作用。H9C2心肌細胞凋亡會發(fā)生明顯的形態(tài)學及功能學變化［9－10］，細胞呈新月狀、結節(jié)狀等不同形態(tài)，染色質凝聚、細胞核裂解、細胞膜整合性喪失。

研究證實，高糖誘導的心肌細胞凋亡與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生密切相關［11］，但機制尚不明確，且目前尚無有效方法阻斷高糖的心肌毒性作用，研發(fā)無血流動力學不良反應的能量代謝干預方法對治療DCM 具有重要意義［12－13］。

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