HCN4和Cx45基因?qū)腴g充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建起搏細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

王帥飛 王 軍 張 浩

緩慢型心律失常包括病態(tài)竇房結(jié)綜合征及 各類心臟傳導(dǎo)阻滯，需要置入人工心臟起搏器治療，但起搏器存在諸如外科侵入性損傷、電池壽命有限、對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)不敏感等缺陷［1］。利用基因技術(shù)使非起搏細(xì)胞表達(dá)起搏電流（If）通道——超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道（HCN），使其具有起搏細(xì)胞的功能［2］。構(gòu)建生物心臟起搏器，除了能避免電子心臟起搏器的缺點(diǎn)之外，還對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)具有良好的自動(dòng)反應(yīng)性。生物起搏頻率緩慢（40～70次／min）是目前生物起搏研究中普遍存在的問題。

對(duì)心肌細(xì)胞間縫隙連接通道的研究發(fā)現(xiàn)，竇房結(jié)細(xì)胞主要表達(dá)連接子蛋白45（Cx45）型連接體，心房肌細(xì)胞主要表達(dá)連接子蛋白43（Cx43）型連接體，兩種細(xì)胞間形成異型連接體通道，電流在此通道只能Cx45→Cx43單向傳導(dǎo)［3］，從而保護(hù)竇房結(jié)細(xì)胞的自律性不受周圍心房肌細(xì)胞電位變化的影響。

本實(shí)驗(yàn)通過將小鼠HCN4基因（mHCN4）導(dǎo)入大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（r MSC），使其過表達(dá)If通道，構(gòu)建起搏細(xì)胞。將小鼠Cx45基因（mCx45）導(dǎo)入mHCN4-r MSC，通過與新生大鼠心室肌細(xì)胞（NRVM）共培養(yǎng)，觀察其起搏功能的變化。

1 方法

1.1 r MSC的分離和培養(yǎng)

4周齡雄性SD大鼠2只，體質(zhì)量120～150 g，由第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。脫頸法處死大鼠，解剖后肢獲取股骨和脛骨，沖洗骨髓腔制備全骨髓細(xì)胞懸液，接種48 h后換液去除未貼壁細(xì)胞，傳至第3代r MSC純度達(dá)到90%以上，可進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染。

1.2 NRV M的分離和培養(yǎng)

1日齡SD大鼠20只，由第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。采用0.1%胰酶消化法分離心肌細(xì)胞［4］，差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞，心肌細(xì)胞的接種濃度為3×105／mL。前3 d心肌細(xì)胞培養(yǎng)液加入0.1 mmol／L 5-溴-2-脫氧尿苷（Brd U，美國(guó)Sig ma公司）抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，可維持心肌細(xì)胞搏動(dòng)2周。

1.3 重組慢病毒的制備

從基因文庫（GeneBank）查詢目的基因mHCN4、mCx45序列，化學(xué)合成c DNA并行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增，同源重組到慢病毒質(zhì)粒p Lenti-CMVEGFP／RFP（上海和元生物）的 Eco RⅠ位點(diǎn)，得到p Lenti-CMV-HCN4-RFP、 p Lenti-CMV-Cx45-EGFP重組慢病毒質(zhì)粒，導(dǎo)入293T細(xì)胞包裝慢病毒，熒光實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定慢病毒液的滴度分別為2.2×108TU／mL、1.93×108TU／mL，對(duì)照慢病毒 p Lenti-CMV-EGFP的滴度為1.89×109TU／mL［5］。

1.4 慢病毒轉(zhuǎn)染r MSC

在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種6孔r MSC，每孔細(xì)胞量4×104，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞融合度為50%，分為實(shí)驗(yàn)組A（轉(zhuǎn)染 HCN4-RFP）、實(shí)驗(yàn)組B（轉(zhuǎn)染 HCN4-RFP＋Cx45-EGFP）和對(duì)照組（轉(zhuǎn)染null-EGFP）。慢病毒轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)（MOI）＝100，助轉(zhuǎn)劑聚凝胺（pol ybrene）使用濃度5μg／mL，轉(zhuǎn)染20 h后換液，轉(zhuǎn)染72 h后熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，并行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染效率［6］。

1.5 電壓鉗記錄If

利用美國(guó)Axon公司的膜片鉗系統(tǒng)Axopatch－1D放大器和p CLAMP軟件以全細(xì)胞模式記錄實(shí)驗(yàn)組 HCN4-MSC（n＝5）和對(duì)照組null-MSC（n＝5）的If?？刂茰囟?5℃，電極芯片電阻2～3.5 MΩ，封接電阻1～2 GΩ，保持電位－50 mV，超極化電壓－50 mV→－120 mV，步階電壓10 mV，超極化電壓鉗制時(shí)間4 s。細(xì)胞外液組分（單位mmol／L）：NaCl 137.7、KCl 5.4、CaCl21.8、Mg Cl21、HEPES 5、葡萄糖10、Ba Cl22，用 Na OH 調(diào)至p H 值7.4。電極液組分（單位 mmol／L）：天冬氨酸鉀80、KCl 50、Mg Cl21、Mg-ATP 3、EGTA 10、HEPES 10，用KOH調(diào)至p H值7.2。

1.6 r MSC與NRV M共培養(yǎng)

在接種NRV M的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板選擇6孔，分別接種實(shí)驗(yàn)組A、實(shí)驗(yàn)組B、對(duì)照組r MSC共培養(yǎng)，隔天記錄各組NRVM（n＝6）的搏動(dòng)頻率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料用ˉx±s表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），多組比較采用LSD-t檢驗(yàn)，采用IBM SPSS 19軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水平α＝0．05。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染r MSC

慢病毒轉(zhuǎn)染72 h后熒光顯微鏡下對(duì)照組表達(dá)片狀綠色熒光，實(shí)驗(yàn)組A表達(dá)片狀紅色熒光，實(shí)驗(yàn)組B同時(shí)表達(dá)片狀紅色熒光和點(diǎn)狀綠色熒光（見圖1）。流式細(xì)胞學(xué)熒光檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染效率：對(duì)照組為（62.3±2.1）%，實(shí)驗(yàn)組 A為（57.1±2.3）%，實(shí)驗(yàn)組B為（58.4±1.1）%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 If

通過電壓鉗全細(xì)胞模式記錄If，對(duì)照組未記錄到If；實(shí)驗(yàn)組mHCN4-MSC記錄到高水平電壓－時(shí)間依從的超極化激活的內(nèi)向性If，If通道激活的超極化電位為 －80 mV，If隨著超極化電位的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)行性增強(qiáng)（見圖2）。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染r MSC熒光觀察（×200）

圖2 實(shí)驗(yàn)組HCN4-MSC的起搏電流

2.3 MSC與NRV M共培養(yǎng)

共培養(yǎng)至第4天起，實(shí)驗(yàn)組A共培養(yǎng)NRV M的搏動(dòng)頻率（70±7）次／min顯著高于對(duì)照組的（60±5）次／min，而實(shí)驗(yàn)組B共培養(yǎng)NRV M的搏動(dòng)頻率（79±8）次／min又顯著高于實(shí)驗(yàn)組A。自共培養(yǎng)第10天起，各組NRV M的搏動(dòng)頻率開始下降，至第14天逐漸停止搏動(dòng)（見圖3）。

圖3 共培養(yǎng)NRVM的搏動(dòng)頻率－時(shí)間關(guān)系

3 討論

在竇房結(jié)細(xì)胞和浦肯野細(xì)胞4期自動(dòng)去極化中發(fā)揮重要作用的離子電流是If［7］。這是一種主要由Na＋負(fù)載的超極化激活的內(nèi)向電流，并且隨膜內(nèi)負(fù)電荷的增加及時(shí)間的推移而逐漸增強(qiáng)。HCN通道是產(chǎn)生If的特異性離子通道［8］，可被Cs＋選擇性阻斷。利用基因技術(shù)使MSC表達(dá)HCN通道，If通過細(xì)胞間縫隙連接進(jìn)入相鄰的NRV M，使其去極化達(dá)到閾電位水平時(shí)產(chǎn)生動(dòng)作電位［9］。

HCN4是哺乳動(dòng)物成熟竇房結(jié)細(xì)胞HCN通道的主要亞型［10］，本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒載體將mHCN4-RFP基因?qū)雛 MSC，熒光顯微鏡觀察紅色熒光蛋白R(shí)FP（＋），電壓鉗全細(xì)胞模式記錄到高水平電壓－時(shí)間依從的超極化激活的內(nèi)向性If，共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)mHCN4-MSC較對(duì)照null-MSC顯著提升了NRV M的搏動(dòng)頻率，說明成功構(gòu)建了生物起搏細(xì)胞。

生物起搏頻率緩慢是目前研究中普通存在的問題［11］。竇房結(jié)細(xì)胞主要表達(dá)Cx45型連接體，心房肌細(xì)胞主要表達(dá)Cx43型連接體，兩種細(xì)胞間形成Cx45-Cx43異型連接體通道，If在此通道只能單向傳導(dǎo)（Cx45→Cx43），從而保護(hù)竇房結(jié)細(xì)胞的自律性不受周圍心房肌細(xì)胞電位變化的影響。m HCN4-MSC和NRV M主要表達(dá)Cx43型連接體［12］，兩種細(xì)胞間形成Cx43-Cx43同型連接體通道，電流在此通道呈雙向傳導(dǎo)，使mHCN4-MSC的起搏頻率易受周圍NRV M超極化電位的抑制。本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒載體將 mCx45-EGFP基因?qū)?mHCN4-MSC，熒光顯微鏡觀察增強(qiáng)綠色熒光蛋白EGFP（＋）提示Cx45 過 表 達(dá)，使 mHCN4-Cx45-MSC 與 相 鄰NRV M形成Cx45→Cx43異型連接體通道，起搏頻率較 mHCN4-r MSC有顯著提升，說明Cx45-Cx43異型縫隙連接通道具有整流特性，能提高生物起搏頻率［13-14］。

目前生物起搏研究多采用腺病毒作為基因載體，由于目的基因無法整合至靶細(xì)胞基因組而僅能短暫表達(dá)，限制了有效起搏時(shí)間。以1型人免疫缺陷病毒為基礎(chǔ)構(gòu)建的慢病毒載體具有將目的基因整合至靶細(xì)胞基因組長(zhǎng)期表達(dá)、轉(zhuǎn)染效率高和免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)［15］。本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒載體將m HCN4和mCx45基因?qū)隡SC構(gòu)建的起搏細(xì)胞能穩(wěn)定傳代，至第10代仍然保持起搏潛能。

本實(shí)驗(yàn)的不足在于構(gòu)建慢病毒載體未添加耐藥基因，而慢病毒轉(zhuǎn)染效率僅達(dá)到60%左右，導(dǎo)致無法篩選出目的基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，這可能是本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的起搏細(xì)胞起搏頻率未能達(dá)到理想水平的重要原因。我們下一步準(zhǔn)備篩選目的基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，建立能長(zhǎng)期穩(wěn)定傳代的 HCN4－Cx45-MSC起搏細(xì)胞系，并進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)起搏細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)，觀察其在動(dòng)物體內(nèi)起搏性能的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和生物安全性。

總之，本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒載體將mHCN4基因?qū)氪笫?MSC，成功構(gòu)建了起搏細(xì)胞，mCx45和mHCN4基因共表達(dá)可以顯著提升其起搏功能。

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