高烏頭生物堿高烏甲素對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用研究

高稚淇謝 紅陳 玲

（1.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，江蘇蘇州215004；2.上海長海醫(yī)院，上海200433）

高烏頭生物堿高烏甲素對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用研究

高稚淇1謝 紅1陳 玲2

（1.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，江蘇蘇州215004；2.上海長海醫(yī)院，上海200433）

目的：研究高烏甲素注射液預(yù)處理和后處理對(duì)大鼠在體心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用。方法：隨機(jī)將48只雄性SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組、高烏甲素預(yù)處理組和高烏甲素后處理組。除假手術(shù)組外其余各組大鼠采用可逆性冠脈左前降支結(jié)扎的方法復(fù)制心肌缺血/再灌注模型，給予大鼠心臟缺血30min再灌注120min；假手術(shù)組不缺血維持生命體征2h。高烏甲素預(yù)處理組于心肌缺血開始前15min靜脈注射高烏甲素注射液（4mg/kg），高烏甲素后處理組于心肌缺血開始后10min靜脈注射高烏甲素注射液（4mg/kg）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用氯化三苯四氮唑染色法（TPT）測(cè)定心肌梗死范圍，并測(cè)定血清中一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）的含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。結(jié)果：模型組大鼠心肌出現(xiàn)缺血、梗死區(qū)，血清NO含量、SOD活性明顯低于假手術(shù)組（P＜0.01），MDA含量明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01），說明造模成功。與模型組比較，高烏甲素預(yù)處理組和后處理組大鼠心肌梗死范圍顯著減少（P＜0.05），NO含量、SOD活性顯著增加（P＜0.01），MDA含量顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論：高烏甲素預(yù)處理和后處理可以減小心肌缺血/再灌注大鼠心肌梗死范圍，其可能通過抗氧化機(jī)制對(duì)缺血再灌注心肌發(fā)揮保護(hù)作用。

高烏甲素 缺血再灌注損傷 心肌缺血 一氧化氮 丙二醛 超氧化物歧化酶 SD大鼠 實(shí)驗(yàn)研究

高烏頭是毛茛科植物高烏頭（Aconitum sinomontanum Nakai）的干燥根，是甘肅、青海、陜西太白地區(qū)、山西、湖北神農(nóng)架地區(qū)、貴州、四川等地的民間草藥，味辛、苦、溫，有毒，具有祛風(fēng)除濕、理氣止痛、活血散瘀的功效，主要用于治療風(fēng)濕腰腿痛、胃痛、心悸、跌打損傷等。高烏頭主要成分為高烏甲素等二萜生物堿，高烏甲素又名拉巴烏頭堿（lappaconitine），臨床常用其氫溴酸鹽，具有強(qiáng)鎮(zhèn)痛作用，還具有抗炎消腫、抗氧化、降溫解熱、抗心律失常、局部麻醉和免疫調(diào)節(jié)等作用[1-3]。還有研究報(bào)道高烏甲素可減輕顱腦創(chuàng)傷（TBI）大鼠的神經(jīng)功能障礙和腦水腫程度，降低血清白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）濃度，從而發(fā)揮對(duì)TBI大鼠的腦保護(hù)作用[4]，但高烏甲素是否具有活血散瘀功能國內(nèi)尚未有研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)基于在體大鼠心肌缺血再灌注模型，研究高烏甲素預(yù)處理及后處理對(duì)心肌缺血性損傷的保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠，體重（200±20）g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK（浙）2008-0033。

1.2 試劑與儀器 高烏甲素（采用氫溴酸高烏甲素注射液，批準(zhǔn)文號(hào):國藥準(zhǔn)字H20023150）；甲醛（西隴化工股份有限公司，批號(hào):140218）；動(dòng)物呼吸機(jī)（ALC-V9，上海奧爾科特生物科技有限公司）；智能恒溫控制儀（JR-1，成都泰盟科技有限公司）；V24E多通道生理記錄儀 （Philips公司，德國）；Anke LXJ-IIB離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；電子分析天平（BT125D，sartorius，德國）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模與給藥 48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、高烏甲素預(yù)處理組、高烏甲素后處理組，每組12只。大鼠采用腹腔注射戊巴比妥鈉（50mg/kg）進(jìn)行麻醉，于右側(cè)頸內(nèi)靜脈和頸內(nèi)動(dòng)脈置入充滿肝素的導(dǎo)管，供補(bǔ)充液體、給藥或監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓之用。氣管切開后插入氣管導(dǎo)管，連接動(dòng)物呼吸機(jī)，行呼氣末正壓通氣，吸入氧濃度30%，調(diào)節(jié)呼吸頻率或潮氣量，維持pH值7.35～7.45、PaCO225～40mmHg（1kPa=7.5mmHg）、PaO290～150mmHg，采用智能恒溫控制儀維持大鼠體溫在36～37℃。于第5肋間行左胸切開術(shù)，打開心包，采用6-0無損傷縫合線在左心耳下緣縫扎左冠狀動(dòng)脈前降支（LAD），縫線末端穿入自制圈套管，止血鉗夾緊圈套管以阻斷LAD血供，建立在體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型[5]，當(dāng)心外膜發(fā)紺蒼白，心電圖示一過性心律失常、ST段弓背向上抬高表示缺血模型成功，松開圈套管進(jìn)行再灌注，可見心外膜重新充血。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，高烏甲素預(yù)處理組于心肌缺血開始前15min經(jīng)尾靜脈注入高烏甲素注射液4mg/kg，高烏甲素后處理組于心肌缺血開始后10min經(jīng)尾靜脈注入高烏甲素注射液4mg/kg。

2.2 指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 血清中超氧化物歧化酶（SOD）活力和一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）含量的測(cè)定 各組大鼠于再灌注末，采用頸總動(dòng)脈插管取血5mL，室溫或37℃恒溫靜置一段時(shí)間后，3000r/min離心10min得血清進(jìn)行分裝，-80℃貯存?zhèn)溆谩Ｑ逯械腘O含量采用硝酸還原酶法測(cè)定，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；SOD采用化學(xué)比色法測(cè)定，測(cè)定波長為550nm；MDA采用硫代巴比妥酸鹽法測(cè)定。

2.2.2 心肌梗死范圍的測(cè)定 采用氯化硝基四氮唑（TPT）染色法[6]。心肌缺血再灌注結(jié)束后，再次阻斷LAD，從頸內(nèi)靜脈注射5%伊文思藍(lán)使左心室（LV）正常區(qū)域藍(lán)染，并迅速取出心臟，分離出LV，并橫斷分割成5～6塊2mm厚的組織。將LV中藍(lán)染的正常組織與未染色的LV缺血區(qū)分離，并都放入0.5%TPT中，37℃水浴15min，10%甲醛過夜以固定組織。在解剖顯微鏡下將LV分成正常、缺血未梗死區(qū)和缺血梗死區(qū)三部分，并分別稱重，計(jì)算缺血區(qū)心肌重量 （缺血未梗死區(qū)心肌重量＋梗死區(qū)心肌重量）占LV心肌重量的百分比，缺血區(qū)心肌重量占危險(xiǎn)區(qū)心肌重量的百分比以及梗死區(qū)心肌重量占LV心肌重量的百分比。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 心肌梗死范圍測(cè)定結(jié)果 各實(shí)驗(yàn)組左心室重?zé)o明顯差異。與模型組比較，高烏甲素預(yù)處理組和高烏甲素后處理組的梗死區(qū)重、梗死區(qū)/左心室、梗死區(qū)/缺血區(qū)均顯著降低（P＜0.05），說明高烏甲素預(yù)處理和高烏甲素后處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。見表1。

表1 各組大鼠心肌梗死范圍比較（±s）

表1 各組大鼠心肌梗死范圍比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)（只）缺血區(qū)重（g）左心室重（g）缺血區(qū)/左心室（%）假手術(shù)組 12梗死區(qū)重（g）0.5831±0.0102 —梗死區(qū)/左心室（%）—梗死區(qū)/缺血區(qū)（%）———模型組 12高烏甲素預(yù)處理組 12高烏甲素后處理組 12 0.5921±0.0204 0.2045±0.0192 0.5590±0.0701 0.1886±0.0276 0.0665±0.021*33.96±2.22 11.42±1.65*33.55±5.67*0.6000±0.0446 0.1789±0.04950.0678±0.033*32.56±2.12 11.22±1.35*33.25±5.34*0.1228±0.0174 36.28±2.56 19.22±2.61 50.77±6.05

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3.2 各組大鼠血清NO、SOD和MDA含量測(cè)定結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清NO含量和SOD活性明顯下降 （P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.05），提示造模成功。與模型組比較，高烏甲素預(yù)處理組和高烏甲素后處理組大鼠血清NO含量和SOD活性明顯升高（P＜0.01），MDA含量顯著降低（P＜0.05）。見表2。

4 討論

缺血性心血管疾病是危害人類健康及生命的一類疾病，且具有發(fā)病率高和致死率高等特點(diǎn)，其致命后果就是由冠狀動(dòng)脈急性閉塞所致的急性心肌梗死及/或心臟性猝死，所以盡早恢復(fù)血流是減輕損傷的關(guān)鍵。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù) （percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）、冠狀動(dòng)脈內(nèi)溶栓（thrombolysis）和冠脈搭橋手術(shù)等治療手段的出臺(tái)可以有效改善缺血，達(dá)到治療目的。然而隨之出現(xiàn)的心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）不僅不能使組織、器官功能恢復(fù)，反而引起心肌進(jìn)一步功能障礙或者心肌細(xì)胞死亡，例如氧自由基堆積、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、細(xì)胞凋亡等，已然成為心臟血管外科手術(shù)取效的主要障礙[7-8]。

一氧化氮（NO，即血管內(nèi)皮舒張因子），在生物體內(nèi)作為一種反應(yīng)性極強(qiáng)的自由基，兼有第二信使和神經(jīng)遞質(zhì)的作用，同時(shí)又是一種效應(yīng)分子，在體內(nèi)具有廣泛的生理作用，如松弛血管平滑肌。超氧化物歧化酶（SOD）對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基（O2-·）保護(hù)細(xì)胞免受損傷。機(jī)體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過氧化物，如醛基（丙二醛），測(cè)試MDA的量常常可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷的程度[9-10]。

有研究表明高烏甲素以及其他幾種從烏頭地上部分分離得到的二萜類生物堿具有抗氧化、抗炎和抗酪氨酸酶活性的作用[11]，另外高烏甲素還可能通過阻滯電位依賴性的鈉離子通道從而降低心肌的收縮力，提高心肌興奮閾，導(dǎo)致心動(dòng)過緩[12]，從而通過減少心肌氧耗發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明，與模型組比較，高烏甲素預(yù)處理及后處理組血清中NO含量、SOD活性顯著提高，MDA含量顯著下降，心肌梗死范圍明顯降低，由此可以推測(cè)高烏甲素可能通過抗氧化機(jī)制對(duì)缺血再灌注心肌發(fā)揮保護(hù)作用。因此，高烏甲素注射液預(yù)處理及后處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，可作為治療缺血性心血管疾病的候選藥物開展進(jìn)一步研究。

表2 各組大鼠缺血再灌注后血清NO、SOD和MDA含量比較（±s）

表2 各組大鼠缺血再灌注后血清NO、SOD和MDA含量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)（只）假手術(shù)組 12模型組 12高烏甲素預(yù)處理組 12高烏甲素預(yù)處理組 12 NO（μmol/L） SOD（U/mL）MDA（μmol/L）58.52±9.65 183.04±4.522.30±0.58 25.38±2.14##144.13±10.03##5.03±1.02##45.67±4.13**163.29±9.32**3.21±0.68*44.69±3.87**170.81±9.51**3.41±0.59*

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編輯：吳 寧

R282.710.5

A

1672-397X（2015）06-0079-03

高稚淇（1985—），女，碩士研究生，住院醫(yī)師，研究方向：麻醉藥物對(duì)心肌的保護(hù)作用。

謝紅，博士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。924831060@qq.com

2015-03-30