錦州地區(qū)副豬嗜血桿菌血清型鑒定

吳明謙，賈麗軍，文艷巧，郭 伶?

（1.遼寧醫(yī)學院畜牧獸醫(yī)學院，遼寧 錦州 121001；2.遼寧省錦州市凌河區(qū)畜牧獸醫(yī)局，遼寧 錦州 121000）

錦州地區(qū)副豬嗜血桿菌血清型鑒定

吳明謙1，賈麗軍2，文艷巧1，郭 伶1?

（1.遼寧醫(yī)學院畜牧獸醫(yī)學院，遼寧 錦州 121001；2.遼寧省錦州市凌河區(qū)畜牧獸醫(yī)局，遼寧 錦州 121000）

本研究先后從錦州市太和區(qū)、凌海、北鎮(zhèn)、黑山、義縣等地采集以多發(fā)性漿膜炎為主要特征的病豬病料13份，在被檢的13份病料中分離到6株疑似副豬嗜血桿菌菌株，同時對所分離的菌株進行了形態(tài)學檢查、分離培養(yǎng)、生化試驗、PCR鑒定及血清型鑒定，最終證實6株為副豬嗜血桿菌，血清型分別為：血清4型1株、血清5型2株、血清12型1株、血清13型2株。本研究初步確定了錦州地區(qū)副豬嗜血桿菌流行菌株的血清型，為豬場制定副豬嗜血桿菌病的防控措施提供理論依據(jù)。

豬；副豬嗜血桿菌；血清型

隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，副豬嗜血桿菌病（Haemophi lus parasuis，HPS）已成為全球范圍內影響?zhàn)B豬業(yè)的一種重要細菌性疾病。在我國，副豬嗜血桿菌病在集約化豬場內發(fā)病率有明顯增加趨勢，主要引起4～9周齡的仔豬發(fā)病，以多發(fā)性漿膜炎、肺炎、關節(jié)炎和腦膜炎等為主要特征，又稱豬格拉氏病，發(fā)病率通常在10%～20%，嚴重時死亡率可達40%以上。本研究先后從太和區(qū)、凌海、北鎮(zhèn)、黑山、義縣等地采集以多發(fā)漿膜炎為主要特征病豬的病料13份，在被檢的13份病料中分離到6株疑似副豬嗜血桿菌菌株，對分離菌株進行了形態(tài)學檢查、分離培養(yǎng)、生化試驗和PCR檢測，同時應用Kieletein-Rapp-Gabrielson（KRG）方法對6株分離菌株進行血清分型。本研究初步確定了錦州地區(qū)副豬嗜血桿菌流行菌株的流行情況，為錦州地區(qū)副豬嗜血桿菌病的研究積累重要的流行病學資料，為更好地防控該病奠定理論基礎。

1 試驗材料

1.1 檢驗材料 自2013年7月到2014年5月，從太和區(qū)、凌海、北鎮(zhèn)、黑山、義縣等地無菌操作采集疑似副豬嗜血桿菌病病死豬的血液、心包液、胸腹腔積水、淋巴結、肺臟等病料，共采集病料13份。

1.2 參考菌株 副豬嗜血桿菌參考菌株由中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；金黃色葡萄球菌菌株和副豬嗜血桿菌標準血清型陽性血清由遼寧醫(yī)學院微生物實驗室制備保存。

1.3 主要試劑 加有20μg/mL煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）（北京希凱創(chuàng)新科技有限公司）和5%滅活新生牛血清的胰酪蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)（上海寶曼生物科技有限公司）；葡萄糖、山梨醇、硫化氫、乳糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、尿素酶等細菌微量生化反應管以及靛基質、甲基紅、V-P試劑盒均購自杭州天和微生物試劑有限公司；PCR Master Mix緩沖液購自北京全式金生物技術有限公司；引物由上海生工生物工程技術有限公司合成[1]。

2 試驗方法

2.1 分離培養(yǎng) 將疑似副豬嗜血桿菌病豬的血液、心包液、胸腹腔積水、淋巴結、肺臟等病料進行細菌的分離培養(yǎng)，將病料經無菌操作劃線接種于含NAD的TSA培養(yǎng)基上，在37℃條件下，并且有5%的CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。挑取培養(yǎng)后的副豬嗜血桿菌疑似菌落進行純培養(yǎng)。

2.2 生化試驗 用接種環(huán)挑取疑似副豬嗜血桿菌的純培養(yǎng)單個菌落，接種于無菌的含NAD的葡萄糖山梨醇、硫化氫、乳糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖尿素酶等生化培養(yǎng)基中，在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察生化試驗反應結果。

2.3 衛(wèi)星現(xiàn)象試驗[2]用接種環(huán)挑取疑似副豬嗜血桿菌的純培養(yǎng)單個菌落，接種于無NAD的鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，再挑取金黃色葡萄球菌垂直劃線接種在該培養(yǎng)基上，在37℃條件下，培養(yǎng)24 h，觀察是否具有“衛(wèi)星生長現(xiàn)象”，同時觀察檢測菌株是否有溶血特性。另取分離菌培養(yǎng)物劃線于無NAD的鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，在37℃條件下，培養(yǎng)24 h，作為對照。

2.4 PCR鑒定[3]挑取TSA培養(yǎng)基上的單菌落進行PCR鑒定。試驗所用的引物參照GenBank等（2001）發(fā)表的HPS-16SrRNA基因進行引物的合成，上游引物為：Hp1 5’-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3’，下游引物為：Hp2 5’-GGCTTCGTCACCCTCTGT–3’，目的擴增片段長度為822 bp。PCR反應體系見表1。

將上述液體試劑混勻后放置于PCR儀上進行PCR反應，反應條件詳見表2。

表1 PCR反應體系Table1 PCR reaction system

表2 PCR反應條件Table2 PCR reaction conditions

2.5 血清型鑒定 用副豬嗜血桿菌1～15型標準陽性血清作對照。對6株分離菌株用KGR試驗進行副豬嗜血桿菌血清型鑒定[4]。

3 試驗結果

3.1 形態(tài)特性 分離菌株在TSA培養(yǎng)基上呈現(xiàn)灰白色圓形半透明的菌落；在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長緩慢，24 h僅生長出直徑1～2 mm的灰白色圓形半透明菌落，無溶血特性；對所分離的菌株進行革蘭氏染色后，菌體為革蘭氏陰性短小桿菌，個別呈兩極濃染的球桿狀，無芽孢。

3.2 生化試驗鑒定結果 試驗結果表明，所分離的副豬嗜血桿菌菌株對葡萄糖、山梨醇、硫化氫、乳糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、尿素酶的生化試驗結果一致，對麥芽糖、甘露醇和乳糖的生化反應不穩(wěn)定。所分離的菌株生化試驗鑒定結果均符合副豬嗜血桿菌標準菌株的生化試驗特征。

3.3 衛(wèi)星現(xiàn)象試驗結果 在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，呈現(xiàn)出明顯的“衛(wèi)星現(xiàn)象”。將分離菌培養(yǎng)物劃線于無 NAD的鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，無菌落生長。試驗結果表明所分離菌株均為NAD生長依賴菌，符合副豬嗜血桿菌培養(yǎng)特征。

3.4 PCR鑒定結果 根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA序列設計特異性引物，經PCR擴增后，DNA片段大小在822 bp。對采自錦州地區(qū)發(fā)病豬場的病料樣本在TSA培養(yǎng)基上分離的單個菌落進行PCR檢測，以DL2000 DNA Marker為標準，可見待檢樣本1為陰性，待檢樣本2、3、4、5、6、7與預期大小相符合為陽性結果見圖1。

3.5 血清型鑒定結果 用副豬嗜血桿菌1～15型標準陽性血清作對照。對分離的6個副豬嗜血桿菌菌株進行血清型鑒定，結果顯示血清4型1株、血清5型2株、血清12型1株、血清13型2株。初步確定了錦州地區(qū)副豬嗜血桿菌流行菌株的血清型，為豬場制定副豬嗜血桿菌病的防控措施提供理論依據(jù)。

4 討論

由于副豬嗜血桿菌生長繁殖營養(yǎng)要求較高，所以不易培養(yǎng)，分離比較困難，致使分離率較低。本研究的分離率僅為46.15%，所以臨床上經實驗室檢驗中未分離到細菌并不代表副豬嗜血桿菌不存在用于副豬嗜血桿菌細菌分離的樣品最好選用未經藥物治療的病豬。

本研究血清型試驗鑒定結果表明，錦州地區(qū)副豬嗜血桿菌流行菌株的血清型為4型、5型、12型13型，不能進行血清分型的有7株，占被檢總數(shù)的46.15%。本試驗結果符合國內外相關報道，Olvera A等[5]報道30%以上的加拿大分離菌株和美國分離菌株不能通過瓊脂擴散試驗分型。蔡旭旺等[6]曾報道副豬嗜血桿菌國內的血清型為血清4型、5型、12型和13型?？梢姡鱾€國家和地區(qū)副豬嗜血桿菌流行的血清型具有一定的差異性。

本研究通過細菌的分離培養(yǎng)、血清型鑒定、分子生物學診斷，確定了錦州地區(qū)副豬嗜血桿菌的血清型，對錦州地區(qū)副豬嗜血桿菌相應診斷方法的建立和本病綜合防控措施的制定具有重要意義。

圖1 Hps 16SrRNA的PCR擴增電泳圖Fig.1 Hps 16SrRNA PCR Amp lified electrophoretic map

[1]郭伶，吳明謙，文艷巧.一例副豬嗜血桿菌病的診斷與防治[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014，06（12）：62-64.

[2]萬世平，王建，葛菲菲，等.副豬嗜血桿菌毒力因子的研究進展[J].畜牧與獸醫(yī)，2010，42（10）：101-104.

[3]郭伶，劉孝剛.遼寧地區(qū)副豬嗜血桿菌血清型的鑒定[J].畜牧與獸醫(yī)，2014，46（03）：91-93.

[4]甘源，馮志新，熊祺琰，等.一株副豬嗜血桿菌的分離與鑒定[J].Animal Husbandry&Veterinary M edicine,2010,42(11)∶64-66.

[5]Olvera A,Pina S,Perez-Simo M,et al.Virulence-associated t rimeric autot ransporters of Haemophi lus parasuis are antigenic proteins expressed in vivo[J].Vet Res,2010,41(3)∶26．

[6]蔡旭旺，劉正飛，陳煥春，等.副豬嗜血桿菌的分離培養(yǎng)和血清型鑒定[J].華中農業(yè)大學學報，2005，24（1）55-58.

Identification of the serotype of Haemophilus parasuis in Jinzhou area

Wu Mingqian1,Jia Li jun2,Wen Yanqiao1,Guo Ling1*
(1.Animal Husbandry and Veterinary Col lege,Liaoning Medical University，Liaoning Jinzhou 121001；2.Linghe District of Jinzhou City Bureau of animal husbandry and veterinary medicine,Liaoning Jinzhou 121000)

This study col lected disease of swine disease 13 materials f rom Jinzhou Taihe Dist rict,Linghai,North Town,Yi County,which the main characteristics was mul tiple serositis.In examination of 13 disease materials we isolated 6 st rains of suspected Haemophi lus parasuis strains, and through the morphological examination,isolation and cul ture,biochemical test and PCR identi fication and serotype identi f ication,we final ly conf irmed that the six st rains of Haemophi lus parasuis,1 st rain of serotype 4,2 st rains of serotype 5,1 st rain of serotype 12,2 st rains of 13 sera type.This study initial ly identi fied the serotypes of Haemophi lus parasuis st rains in Jinzhou area,and provided a theoretical basis for swine formulation about Haemophilus parasuis disease’s prevention and cont rol.

Pig;Haemophilus parasuis;Serumtype

S852.61

1672-9692(2015)06-0033-04

2015-04-18

吳明謙(1990-)，男，本科在讀。

郭伶（1969-），女，碩士生導師，教授，研究方向為預防獸醫(yī)學。

遼寧醫(yī)學院“校長基金-奧鴻博澤基金”；遼寧省教育廳大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目。