遼寧絨山羊羔羊卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的研究

張曉鷹，宋先忱，張興會，豆興堂，楊秋鳳，郭 丹

（遼寧省畜牧科學(xué)研究院，遼寧 遼陽 111000）

遼寧絨山羊羔羊卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的研究

張曉鷹，宋先忱，張興會，豆興堂，楊秋鳳，郭 丹?

（遼寧省畜牧科學(xué)研究院，遼寧 遼陽 111000）

本研究以4～8周齡的遼寧絨山羊母羔為研究對象，研究不同激素處理對羔羊卵泡發(fā)育數(shù)量和發(fā)育質(zhì)量的影響，同時還比較了不同配方的培養(yǎng)液對羔羊卵母細(xì)胞體外成熟率的影響。結(jié)果表明：最佳的母羔超數(shù)排卵方案是依次注射PMSG 400 IU 1次，F(xiàn)SH（加拿大）40 mg 3次，間隔時間12 h；在成熟培養(yǎng)液中添加15%的發(fā)情羊血清（ESS）卵母細(xì)胞的體外成熟率最高。

絨山羊；羔羊；超數(shù)排卵；體外培養(yǎng)

幼齡絨山羊，經(jīng)激素刺激其卵泡發(fā)育，超數(shù)排卵效果顯著，能夠取出可用卵母細(xì)胞數(shù)是成年絨山羊超排的5～8倍，可有效利用優(yōu)秀母羊的種質(zhì)資源，生產(chǎn)體外胚胎，是迅速提高絨山羊群體質(zhì)量的有效途徑，并且能夠?qū)⒔q山羊的世代間隔縮短至6～7個月，提高遺傳進(jìn)展，真正地實現(xiàn)了早期選種，對迅速提高絨山羊群體品質(zhì)、縮短世代間隔、增加遺傳進(jìn)展具有十分顯著的作用[1]。常建偉等[2]研究表明4周齡羔羊的激素誘導(dǎo)效果最佳，8周齡后采卵數(shù)明顯下降。因此，本研究選用4～8周齡的幼齡遼寧絨山羊開展相關(guān)研究。

1 試驗材料

1.1 供體羔羊 選擇4～8周齡、5～8 kg體質(zhì)健康、體況良好、精神狀態(tài)佳的處于哺乳期的羔羊30只，隨機(jī)分為6組，每組5只，由遼寧省遼寧絨山羊育種場有限公司提供。

1.2 主要儀器設(shè)備 活體采卵泵：Craf t，英國；電子天平：AB135-S，瑞士；CO2培養(yǎng)箱：HERACELL 150，美國；超純水儀：Pulse 1+PURELAB f lex，美國ELGA；顯微鏡：Leica M165C，德國。

1.3 超數(shù)排卵及同期發(fā)情藥物 促卵泡素FSH（100 IU/支，寧波第二激素廠產(chǎn)）、促卵泡素FSH（400 mg/瓶，加拿大產(chǎn)）、孕馬血清促性腺激素PMSG（1 000 IU/支，寧波市三生藥業(yè)有限公司產(chǎn)）、促黃體素LH（40 mg/瓶，加拿大產(chǎn)）。

1.4 卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)藥物 Medium 199（with Ear le’ssal ts）：M3769，Sigma；FSH：400 mg/瓶批號：R9D19A，加拿大；促黃體素LH：R8K03VB，加拿大；肝素：H01923，Bioszune分裝；發(fā)情羊血清（ESS）：絨山羊發(fā)情當(dāng)天用常規(guī)血清制備法自制56℃滅活處理30 min；Mineral oi l：M5904，規(guī)格：500 mL，Sigma分裝；E2：E8875，Sigma分裝其他試劑除特殊說明外均購自Sigma公司。

2 試驗方法

2.1 羔羊的超排方案 羔羊超數(shù)排卵采取后腿內(nèi)側(cè)肌肉注射FSH、LH、PMSG等促發(fā)情藥物，分4次注射，每次間隔12 h，具體操排方案如表1所示。各超排藥物需統(tǒng)一用稀釋液溶解后，用移液器按計量分裝到EPPENDOF管內(nèi)，冷凍保存，避免藥物因反復(fù)凍融而導(dǎo)致成分的變化。

表1 羔羊超數(shù)排卵處理方案表Table1 Lam b superovulation treatm ent schem e table

2.2 卵母細(xì)胞的采集 采卵方法為常規(guī)手術(shù)法，在超排處理最后一針結(jié)束后10～12 h手術(shù)，采用活體采卵方法收集卵母細(xì)胞，用10 mL注射器抽吸卵巢上2～6 mm卵泡內(nèi)的卵泡液，轉(zhuǎn)移入離心管中，在無菌操作間用實體顯微鏡撿取卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）。

采卵液：M199+5 mmol/L NaHCO3+10 mmol/L HEPES+10 mmol/L HEPES-Na+0.01 g/L肝素鈉+1% FCS+0.065 g/L青霉素G鈉+0.05 g/L鏈霉素鈉

2.3 卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)2.3.1 培養(yǎng)液的配制

①卵母細(xì)胞成熟液Ⅰ：M199原液+5%ESS+10 μg/mL FSH+10μg/mL LH+1μg/mL E2

②卵母細(xì)胞成熟液Ⅱ：M199原液+10%ESS+10 μg/mL FSH+10μg/mL LH+1μg/mL E2

③卵母細(xì)胞成熟液Ⅲ：M199原液+15%ESS+10 μg/mL FSH+10μg/mL LH+1μg/mL E2

④卵母細(xì)胞成熟液Ⅳ：M199原液+20%ESS+10 μg/mL FSH+10μg/mL LH+1μg/mL E2

2.3.2 培養(yǎng)方法 將獲得的卵母細(xì)胞用采卵液漂洗干凈后，將檢出的COCs分為A、B、C、D 4級，A級擴(kuò)展且顏色較暗，卵丘細(xì)胞有5層以上包裹的胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞；B級卵丘細(xì)胞顏色較淺且稀疏，卵丘細(xì)胞有5層以上包裹的胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞；C級有3～5層卵母細(xì)胞緊密包裹的均勻胞質(zhì)卵母細(xì)胞；D級卵丘細(xì)胞稀少，胞質(zhì)不均勻。本研究中，將A、B級的卵母細(xì)胞檢出用于細(xì)胞成熟培養(yǎng)，在成熟液中洗3次，移入100μL成熟液滴中（Nunc產(chǎn)35 mm×10 mm培養(yǎng)皿，液滴上覆蓋礦物油，在培養(yǎng)皿中預(yù)先培養(yǎng)2 h），每個液滴放入15～20枚卵母細(xì)胞，置于5%CO2、飽和濕度和38.5℃的二氧化碳培養(yǎng)皿中，成熟培養(yǎng)24 h。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 主要使用SPSS 11.5軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計與分析。

回收率=回收到的卵母細(xì)胞數(shù)/卵泡數(shù)×100%

可用率=A、B級卵母細(xì)胞數(shù)/回收到的卵母細(xì)胞數(shù)×100%

卵母細(xì)胞成熟率=排出第一極體的細(xì)胞數(shù)/培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)×100%

3 結(jié)果與分析

3.1 不同超排方案超排效果的比較 見表2。

表2 羔羊不同超排方案的超排效果Tab le2 Lam b o f so lution used different drainage e ffect

圖1 超排后的卵巢和吸卵過程Fig.1 Process of the ovaries and suck eggs

由表2可知，6種超排方案獲得的平均卵泡數(shù)分別為50.32、70.69、99.84、100.88、80.36和96.87枚，方案1和方案2超排的卵母細(xì)胞的數(shù)量顯著低于其他4個方案（P＜0.05），方案3和方案4超排的卵母細(xì)胞的數(shù)量顯著高于方案5和方案6（P＜0.05）。但從所獲得的卵泡大小來看，所有處理組所獲得的卵泡的大小均集中在2～4 mm上，方案1、2、3、4卵泡直徑4 mm以上的卵泡數(shù)均占所有卵泡數(shù)的6%，只有方案5和方案6的4 mm以上的卵泡數(shù)較多，分別占12%和11%。MORTON K M1等[3]研究表明，直徑在4 mm以上過大的卵泡所獲得卵母細(xì)胞的體外成熟率和受精率上都相對較低。

3.2 不同超排方案卵泡發(fā)育質(zhì)量的比較 見表3。

表3 羔羊不同超排方案卵泡發(fā)育質(zhì)量的比較Tab le3 Different com parison of schem es of fo llicu lar quality lam b

圖2 體外成熟后的卵母細(xì)胞Fig.2 After in vitro maturation of oocytes

采用6種超排方案對30只幼齡的遼寧絨山羊進(jìn)行超數(shù)排卵，對比回收卵數(shù)量、可用卵數(shù)量和成熟數(shù)量。由表3可知，6種超排方案采集到的卵母細(xì)胞和可用卵母細(xì)胞分別為33.2、43.7、 78.8、 85.8、 64.3、 79.5枚 和 25.9、 33.7 59.9、66.9、49.5、60.4枚?；厥章屎涂捎寐史謩e為66.2%、72.5%、79.8%、85.6%、80.3%、82.7%和78.2%、77.9%、6.5%、78.3%、77.8%、76.2%除了卵母細(xì)胞回收率方案1和方案2顯著低于其他方案外（P＜0.05），6個方案在卵母細(xì)胞回收率和可用率上均差異不顯著（P＞0.05），說明不同的激素超排對卵母細(xì)胞不同等級的比率影響不顯著（P＞0.05），可以忽略不計。而6個方案的體外成熟數(shù)和體外成熟率分別為11.6、16.8、28.7、43.5、19.8、27.2和 45.8%、50.1%、48.3%、 65.4%、40.5%、45.9%。方案4的體外成熟率顯著高于其他方案（P＜0.05），說明方案4是羔羊超數(shù)排卵的最佳方案。方案2、4、6的體外成熟率都在50%以上，說明利用加拿大產(chǎn)的FSH進(jìn)行超排處理，能夠有效提高體外成熟的效率，且超排出的卵母細(xì)胞質(zhì)量較國產(chǎn)的FSH要好。

3.3 不同成熟培養(yǎng)體系成熟效果的比較 見表4。分別按照上述4個卵母細(xì)胞成熟液配方，對從羔羊卵巢上采得的卵母細(xì)胞做體外成熟培養(yǎng)，在體式顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞的成熟效果，以排出第一極體為卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志，比較使用各配方所獲得的卵母細(xì)胞的成熟率。從表4中可以看出，卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液Ⅲ的成熟率最高，顯著地高于成熟培養(yǎng)液Ⅰ和Ⅳ（P＜0.05），而與成熟培養(yǎng)液Ⅱ差異不顯著（P＞0.05），這說明在羔羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)方面，發(fā)情羊血清（ESS）的添加量以10%～15%為宜，卵母細(xì)胞的成熟率較高。

表4 不同培養(yǎng)液對羔羊卵母細(xì)胞體外成熟效果比較Table4 The different cultures o f the lam b in vitro m aturation of oocytes e ffect com parison

4 結(jié)論與討論

4.1 不同超排方案超排效果的比較 影響羔羊超數(shù)排卵的效果的因素有很多，包括羔羊的健康程度、羔羊的日齡和羔羊的體重等因素[4]。本研究中盡量選擇了體重相近、日齡相近、健康無疾病的羔羊作為試驗羊，排除了羔羊本身差異給試驗帶來的影響。那么誘導(dǎo)激素的種類、用量和注射程序、不同廠家（或同一場家不同批次生產(chǎn)的同一藥品）成為影響羔羊超排效果的主要因素。羔羊超數(shù)排卵經(jīng)常使用的激素有FSH、PMSG等。PMSG的半衰期較長，使用后代謝的時間也會較長，而FSH的半衰期較短，因此要重復(fù)多次注射，處理程序比較繁瑣。本試驗開始采用的FSH與LH組合的方式進(jìn)行超排，但超排效果不顯著，無論是在超排所獲得卵母細(xì)胞的數(shù)量上還是質(zhì)量上都不太理想?？紤]PMSG具有FSH和LH的雙重功效，因此設(shè)計了方案3、4、5、6結(jié)果表明，PMSG與FSH組合進(jìn)行羔羊的超數(shù)排卵效果較好，超排的卵母細(xì)胞數(shù)量較多。然而注射PMSG后導(dǎo)致卵泡比較大，體外成熟培養(yǎng)效果不好。而第一針注射PMSG更有利于成熟因子在卵泡液中的積累，使卵母細(xì)胞的成熟率相對得到提高。

目前國內(nèi)外應(yīng)用的FSH主要有兩種，分別是寧波產(chǎn)FSH和加拿大產(chǎn)FSH。加拿大產(chǎn)FSH具有高效、穩(wěn)定性強(qiáng)等特點，對羔羊超數(shù)排卵的效果較好，但價格較貴，超數(shù)排卵成本較高。Kel ly等[5[6]采用加拿大產(chǎn)FSH進(jìn)行超排處理，平均卵母細(xì)胞數(shù)達(dá)82枚。本試驗比較了加拿大產(chǎn)FSH和寧波產(chǎn)FSH的超排效果，結(jié)果二者在獲得卵泡數(shù)、回收卵數(shù)和可用卵數(shù)上沒有顯著差異，加拿大產(chǎn)FSH要略高于寧波產(chǎn)FSH，但是在卵母細(xì)胞成熟率上，加拿大產(chǎn)FSH要顯著高于寧波產(chǎn)FSH，而且寧波產(chǎn)FSH穩(wěn)定性差，不同羔羊個體間超排效果差異較明顯。

4.2 不同成熟培養(yǎng)體系成熟效果的比較 血清成分非常復(fù)雜，除含有多種細(xì)胞因子外，還包括其他一些生物活性物質(zhì)，其中某些成分對細(xì)胞有營養(yǎng)功能和支持功能兩方面的作用，但有些物質(zhì)可能會影響細(xì)胞的發(fā)育[7]。因此血清對細(xì)胞的作用也可能是多元的，細(xì)胞對外界環(huán)境的變化非常敏感，血清中有利成分對細(xì)胞發(fā)育有促進(jìn)作用，而一些不利因素也會影響細(xì)胞的發(fā)育，因此在細(xì)胞培養(yǎng)中，血清的添加量對于細(xì)胞的發(fā)育尤其重要。本試驗對比了卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中添加5%、10%、15%、20%的ESS，結(jié)果顯示，15%添加量的體外成熟培養(yǎng)液的卵母細(xì)胞成熟率最高，由此可見，在羔羊體外培養(yǎng)液中，添加15%的ESS是比較合適的。

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The study of Liaoning cashmere goats lamb superovulation and oocytesin vitro maturation

Zhang Xiaoying,Song Xianchen,Zhang Xinghui,Dou Xingtang, Yang Qiufeng,Guo Dan*
（Animal Husbandry Institute of Liaoning Province,Liaoning Liaoyang 111000）

In this study,4～8 week-old Liaoning cashmere goats female lamb were used for the research of di f ferent hormone t reatment on fol l icular development quantity and quality.And Di fferent medium formulations for lamb oocyte in vit ro maturation rate were discussed as wel l.The resul ts showed that∶the best female lambs superovulation program is fol lowed by injection of PMSG 400 IU for 1 time,and FSH(Canada)40 mg for 3 times with intervals of 12h each.In oocytes maturation experiment,add 15%(v/v)of the est rous goat serum(ESS)in maturation medium got the highest in vitro maturation rate.

Cashmere goats;Lamb;In vitro cul ture;Superovulation ovulation

S827

1672-9692(2015)06-0013-06

2015-03-25

張曉鷹（1970-），男，本科，高級畜牧師，主要從事絨山羊飼養(yǎng)管理工作。

郭丹（1981-），女，碩士，高級畜牧師，主要從事絨山羊育種工作。

遼寧省自然科學(xué)基金項目——絨山羊羔羊體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)的研究（201202110）