UV 和HPLC 法測(cè)定黃芩黃酮總苷元提取物中總黃酮和3 種主要成分的含量

彭易蘭，劉云華，黃志芳，劉玉紅，陳 燕，易進(jìn)海*

1成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 611137;2 四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，成都 610041

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi 的干燥根，具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎的功效［1］，主要成分為黃芩苷、漢黃芩苷及少量的苷元等黃酮類成分［2］，其中黃芩苷的含量最高，故黃芩及其成方制劑中都以黃芩苷作為質(zhì)控指標(biāo)。藥代動(dòng)力學(xué)研究證明，苷類成分在腸道內(nèi)難以吸收、生物利用度低、腸內(nèi)滯留時(shí)間較長(zhǎng)而易受到腸道菌群的作用，苷經(jīng)腸道細(xì)菌代謝后被水解，生成苷元而發(fā)揮其藥理作用［3，4］;如文獻(xiàn)報(bào)道黃芩苷在腸道內(nèi)難以被直接吸收，轉(zhuǎn)化為黃芩素才能被吸收入血液而發(fā)揮作用［5-7］，同時(shí)大量臨床藥效實(shí)驗(yàn)證明，黃芩素的藥理作用強(qiáng)于黃芩苷［5］。因此，將黃芩黃酮苷類成分轉(zhuǎn)化苷元，提高其生物利用度和藥理作用是有效提高黃芩藥效的重要方法。黃芩黃酮苷元的主要成分黃芩素有抗菌消炎、抗病毒、降低血清膽固醇等作用［8，9］;漢黃芩素有抗氧化、抗腫瘤等生物活性［10］;千層紙素A 有抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)等活性［11］。本文采用簡(jiǎn)便的工藝方法，利用黃芩藥材中自身的黃芩酶水解黃芩苷，經(jīng)提取得到黃芩黃酮總苷元，分別采用UV 法、HPLC 法測(cè)定總黃酮和黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A 的含量，從總黃酮和3 種主要有效成分的含量來(lái)表征黃芩黃酮總苷元提取物，為其質(zhì)量控制提供科學(xué)的參考方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀系列(包括四元泵，DAD 檢測(cè)器，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器，工作站)，759S 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，KQ-300B 型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有公司)，AUW200D 型1/10 萬(wàn)電子天平(日本島津)，Milli-Q Integral 3 超純水機(jī)(美國(guó)Millipore)，電子恒溫水浴鍋(DZKW-4)，真空干燥箱(上海2K-82A)。

1.2 試藥

對(duì)照品黃芩素(批號(hào)111595-200905)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用;對(duì)照品漢黃芩素(批號(hào)MUST-14110311)、千層紙素 A (批號(hào)MUST-14112104)均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司，供含量測(cè)定用。黃芩藥材購(gòu)自成都荷花池藥材市場(chǎng)，經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院舒光明研究員鑒定為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi 的干燥根。甲醇為色譜純;水為超純水;其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩黃酮總苷元提取物制備

黃芩藥材粉碎過(guò)10 目篩，第一次加水12 倍，第二次和第三次各加水10 倍，于0～10 ℃動(dòng)態(tài)攪拌提取三次，每次0.5 h，過(guò)濾，合并濾液，緩慢升溫至60℃并保溫酶解6 h，過(guò)濾，減壓干燥，即得。

2.2 HPLC 測(cè)定黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A 的含量

2.2.1 溶液制備

2.2.1.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液

精密稱取黃芩素對(duì)照品5.47 mg 置25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到黃芩素對(duì)照品儲(chǔ)備液(每1 mL 中含黃芩素0.2188 mg);精密稱取漢黃芩素5.20 mg 置25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到漢黃芩素對(duì)照品儲(chǔ)備液(每1 mL 中含漢黃芩素0.2080 mg);精密稱取千層紙素A 5.22 mg 置25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到千層紙素A 對(duì)照品儲(chǔ)備液(每1 mL 中含千層紙素0.2088 mg)。

2.2.1.2 混合對(duì)照品溶液

分別精密吸取黃芩素，漢黃芩素，千層紙素A對(duì)照品儲(chǔ)備液8、2、1 mL 置25 mL 容量瓶中加甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL 含黃芩素70.016 μg、漢黃芩素16.640 μg、千層紙素A 8.352 μg 的溶液，搖勻，即得。

2.2.1.3 供試品溶液

圖1 混合對(duì)照品(A)、供試品(B)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standard (A)and sample (B)

取黃芩提取物約16 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻;精密吸取0.5 mL 置5 mL 容量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜條件:色譜柱Eclipse XDB-C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);柱溫:35 ℃;流動(dòng)相:甲醇-0.2%磷酸水(50∶50);流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):275 nm;分析時(shí)間40 min。

系統(tǒng)適用性試驗(yàn):分別精密吸取混合對(duì)照品溶液5 mL 及供試品溶液10 μL 進(jìn)樣，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A 均能達(dá)到基線分離，理論板數(shù)均大于8000，分離度均大于2.8。

2.2.3 線性關(guān)系考察

分別精密量取混合對(duì)照品溶液0.5、2、4、6、8、10 mL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得系列濃度(6 個(gè)濃度)對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液10 μL 分別注入液相色譜儀，測(cè)得峰面積。以進(jìn)樣濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A 的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Table 1 Regression equation，correlation coefficient and linear range of baicalein，wogonin and oroxylin A

結(jié)果表明:黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A 分別在3.501～70.016，0.832～16.640，0.418～8.352 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液(No.2)10 μL，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A 色譜峰面積的RSD 分別為0.83%、0.34%、0.73%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液(No.2)10 μL，在上述色譜條件下在24 h 內(nèi)每隔4 h 進(jìn)樣測(cè)定，黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A 色譜峰面積的RSD 分別為1.38%、0.78%和1.46%。結(jié)果說(shuō)明在24 h 內(nèi)檢測(cè)穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品(No.2)，按“2.2.1.3”項(xiàng)下方法平行操作制備6 份供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A 的含量(n=6)分別為60.39%、13.00% 和6.38%;RSD 分別為0.94%、1.20%和1.29%。結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn)

稱取黃芩提取物(No.2)，平行6 份，精密稱定，分別精密加入黃芩素對(duì)照品的甲醇溶液(1.094 mg/mL)5 mL、漢黃芩素對(duì)照品的甲醇溶液(1.04 mg/mL)1 mL、千層紙素A 對(duì)照品的甲醇溶液(0.52 mg/mL)1 mL，以下按“2.2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。

表2 黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A 加樣回收率結(jié)果Table 2 Recovery experiment results of baicalein，wogonin and oroxylin A

結(jié)果表明該方法回收率度良好。

2.2.8 樣品中黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A 的測(cè)定

取各批次黃芩提取物樣品，按“2.2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，記錄峰面積，含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3 UV 法測(cè)定總黃酮含量

2.3.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取黃芩素對(duì)照品5.34 mg 置25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到黃芩素對(duì)照品儲(chǔ)備液;精密吸取黃芩素儲(chǔ)備液1 mL 置50 mL 容量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL 中含黃芩素4.272 μg)。

2.3.2 供試品溶液

取黃芩提取物(No.2)約16 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻;精密吸取0.5 mL 置50 mL 容量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 最大吸收波長(zhǎng)的選擇

以甲醇作為空白溶劑，取黃芩素對(duì)照品溶液和供試品溶液(No.2)在紫外分光光度儀于200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描測(cè)定吸收曲線，結(jié)果表明黃芩素對(duì)照品溶液和供試品溶液在275 nm 處均有最大吸收，所以選擇275 nm 作為總黃酮測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3.4 線性關(guān)系考察

分別準(zhǔn)確吸取黃芩素對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于25 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得系列濃度(5 個(gè)濃度)對(duì)照品溶液，在275 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以溶液濃度(X)為橫坐標(biāo)，以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.0976X +0.0153，r=0.9991。黃芩素濃度在1.7088～8.5440 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn)

取供試品溶液(No.2)連續(xù)測(cè)定5 次，記錄吸光度值，RSD 為0.3%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液(No.2)，室溫放置0、2、4、6、8 h 分別測(cè)吸光度。記錄吸光度值，吸光度分別為0.4443、0.4444、0.4482、0.4471、0.4487，RSD=0.46%，說(shuō)明在8 h 內(nèi)檢測(cè)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取同一樣品(No.2)6 份，按“2.3.2”項(xiàng)下平行操作制備供試品溶液，在275 nm 檢測(cè)，記錄吸光度值，結(jié)果測(cè)得總黃酮的平均含量為91.12%，RSD=1.36%。結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱取黃芩提取物(No.2)約8 mg，平行6 份，精密稱定，精密加入與樣品中含量約等量的黃芩素對(duì)照品，按“2.3.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，在275 nm分別測(cè)吸光度，計(jì)算回收率，平均加樣回收率(n=6)為100.93%，RSD 為2.63%，即該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3.9 總黃酮含量的測(cè)定

取各批次黃芩提取物樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于275 nm 下測(cè)定吸光度，含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 五批黃芩提取物中黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A 和總黃酮的含量Table 3 The contents of baicalein，wogonin，oroxylin A and total flavonoids

3 討論與結(jié)論

黃芩藥材中含有黃芩酶，在適宜的溫度等條件下，黃芩酶水解黃芩苷轉(zhuǎn)化為黃芩素，文獻(xiàn)報(bào)道黃芩藥材加水濕潤(rùn)，保溫、酶解，再用乙醇回流提取得到黃芩苷元［12，13］，但該方法由于使用乙醇不僅生產(chǎn)成本高，而且?guī)胫苄噪s質(zhì)導(dǎo)致黃芩素含量較低。本文應(yīng)用新的工藝方法，在低溫條件下(0～10 ℃)動(dòng)態(tài)攪拌同時(shí)提取黃芩苷和黃芩酶，此時(shí)黃芩酶的活性被抑制，水提液經(jīng)離心過(guò)濾后再升溫至60 ℃，恢復(fù)酶的活力，保溫酶解6 h，HPLC 檢測(cè)表明黃芩苷全部水解為黃芩素，黃芩素難溶于水，析出沉淀，過(guò)濾，干燥，得到黃芩黃酮總苷元提取物，且有效成分含量高。

本文黃芩黃酮總苷元生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便，成本低，而且有效成分含量高，優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的方法［12，13］。建立了UV 法、HPLC 法測(cè)定上述黃芩黃酮總苷元提取物中總黃酮和黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A 的含量，方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，結(jié)果表明其主要有效成分為黃芩素，含量為48.22%～60.36%，漢黃芩素含量為12.09%～14.46%，千層紙素A 含量為5.05%～8.81%，總黃酮含量為78.11%～90.12%，有效成分明確，可測(cè)成分含量高，從總黃酮和3 種主要成分的含量來(lái)表征黃芩黃酮總苷元提取物，為其應(yīng)用和質(zhì)量控制提供參考方法。

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