丹皮酚及其結(jié)構(gòu)類似物的修飾與抗炎活性研究

姜玉才，彭永練，陳莉敏

福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福州 350004

丹皮酚(paeonol)又稱牡丹酚，化學(xué)名2-羥基-4-甲氧基-苯乙酮，主要是從蘿藦科植物徐長卿干燥根或全草和毛茛科植物牡丹根皮中提取分離出來的一種小分子的酚類化合物［1］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，丹皮酚具有廣泛的生物活性，例如抑菌抗炎［2］、抗氧化［3］、降壓利尿［4］、抗凝血［5］、抗過敏［6］、抗腫瘤［7］、增加巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞的活性［8］等作用。同時關(guān)于丹皮酚及丹皮酚結(jié)構(gòu)類似物例如2-羥基-5-甲氧基-苯乙酮、3-羥基苯乙酮、2-羥基苯乙酮和3-甲氧基苯酚等這些物質(zhì)均有類似的生物活性［9］。非甾體抗炎藥(NSAIDs)是全世界范圍內(nèi)處方量最大的藥物之一，但長期大劑量服用NSAIDs 會引起許多不良反應(yīng)，特別是消化道損傷［10］。本文利用拼合原理將臨床上常用的NSAIDs 布洛芬與丹皮酚及結(jié)構(gòu)類似物偶聯(lián)制成孿藥(其中四個為新化合物)，期望偶聯(lián)物能增強其解熱鎮(zhèn)痛抗炎的活性，減少布洛芬的羧基對消化道的直接刺激作用，或利用丹皮酚及結(jié)構(gòu)類似物的抗氧自由基作用減少胃潰瘍的產(chǎn)生;增加脂溶性，減少藥物在消化道的停留時間。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AVATR330FT-IR 紅外光譜儀(美國Thermo Nicolet 公司)，KBr 壓片法;三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀(美國G6410B);核磁共振波譜儀(BRUKER，BIOSPIN，AVANCE Ⅲ)，TMS 為內(nèi)標(biāo)，CDCl3為溶劑;WRS-1B 數(shù)字熔點儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

布洛芬(99%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司);丹皮酚(99%)、2-羥基苯乙酮(99%)、3-羥基苯乙酮(98%)、2-羥基5-甲氧基苯乙酮(99%)、4-二甲氨基吡啶(DMAP，99%);二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，99%)均購自上海晶純生化科技股份有限公司;其余試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 丹皮酚及結(jié)構(gòu)類似物與布洛芬的縮合

以五種不同的丹皮酚及結(jié)構(gòu)類似物為原料，與布洛芬反應(yīng)合成種目標(biāo)產(chǎn)物(A～E)，合成路線如圖1 所示:

圖1 丹皮酚及結(jié)構(gòu)類似物修飾的合成路線Fig.1 Synthetic routes of paeonol analogues

路線(1)為酰氯法:參考文獻［11］并作適當(dāng)改進，將5.0 mmol 布洛芬溶于10 mL 氯仿，置于50 mL 單頸瓶中，加入氯化亞砜1.5 mL，攪拌回流3 h，減壓蒸去氯化亞砜。殘留物溶解在氯仿中，冰浴冷卻至0℃，緩慢滴加丹皮酚或2-羥基苯乙酮、3-羥基苯乙酮、2-羥基-5-甲氧基-苯乙酮、3-甲氧基苯酚5.0 mmol 和吡啶0.8 mL 的混合溶液，冰浴下攪拌2 h，室溫反應(yīng)過夜，加入10 mL 蒸餾水，二氯甲烷萃取(10 mL ×3)，合并有機相，依次用飽和碳酸氫鈉溶液、蒸餾水和飽和食鹽水溶液洗滌，用無水硫酸鎂干燥過夜。過濾，濾液濃縮，進行柱層析，洗脫液蒸去溶劑，油泵抽干，用少量的石油醚溶解，放置-20℃冰箱中過夜后，油泵抽去石油醚，得到目標(biāo)化合物。

路線(2)為DCC 法［12］:將5.0 mmol 布洛芬溶于10 mL 氯仿，置于50 mL 單頸瓶中，加入DCC 5 mmol，室溫攪拌0.5 h，加入DMAP 100 mg，攪拌至溶解。室溫繼續(xù)攪拌0.5 h，分別加入丹皮酚或2-羥基苯乙酮、3-羥基苯乙酮、2-羥基-5-甲氧基-苯乙酮、3-甲氧基苯酚5mmol，反應(yīng)48 h，過濾，濾液濃縮，進行柱層析，洗脫液蒸去溶劑，油泵抽干，得到目標(biāo)化合物。

1.2.2 抗炎活性的測定［13］

采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹法:受試化合物A、B、C、D、E 和布洛芬均用0.5% CMC-Na 溶液配制成1.59 ×10-3mol/L 的混懸液，油狀物溶于總體積5%的二甲亞砜后混懸于0.5% CMC-Na 溶液中。取健康ICR 小鼠60 只，體重20 ±2 g，雌雄各半，隨機分為6 組，每組10 只，分別為模型組，陽性藥組(布洛芬)，受試化合物組。給藥前禁食12 h，自由飲水。小鼠灌胃給藥，給藥容量為0.2 mL/10g。給藥1 h后將小鼠右耳廓兩側(cè)用微量進樣器均勻涂布二甲苯20 μL 致炎，左耳廓做對照。致炎1 h 后將小鼠脫頸椎處死，沿耳廓基線取下兩耳，用7 mm 打孔器于同一部位各取下一耳片用電子天平稱重，致炎耳片重量減去對照側(cè)耳片重量即為腫脹度。將各組數(shù)據(jù)進行t 檢驗，比較組間差異的顯著性。并將對照組與給藥組進行統(tǒng)計學(xué)分析處理。按下式計算抑制率(%):

抑制率%=(對照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/對照組平均腫脹度×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 合成路線的選擇

酚羥基與羧基的縮合方式有很多，較常用的有酰氯法和DCC 法。其中酰氯法產(chǎn)物除了酰氯外均為氣體，往往不需提純即可應(yīng)用，純度好，產(chǎn)率高。但是如果所生成酰氯的沸點與氯化亞砜的沸點相近，則與氯化亞砜不易分離;另外此方法氯化亞砜對設(shè)備腐蝕嚴(yán)重，生成的酸對環(huán)境污染大。而采用DCC 法，用DCC 為脫水劑，DMAP 為催化劑，可以直接與酚制備得到酯，條件溫和，簡單方便，產(chǎn)率高。而且生成產(chǎn)物除了酯外，即為雙環(huán)己基脲，它以固體狀態(tài)析出，經(jīng)過濾即可除去。本文前期試驗中分別采用此2 種方法合成了目標(biāo)化合物，發(fā)現(xiàn)用酰氯法制備，產(chǎn)率較高，但操作步驟復(fù)雜，對環(huán)境污染較大;而采用DCC 法，雖然產(chǎn)率相對較低，但操作步驟簡單，更加環(huán)保。經(jīng)綜合比較，最終選用DCC 法。

表1 DCC 法和酰氯法目標(biāo)化合物的產(chǎn)率的比較Table 1 Comparison of the yield of targeted compounds synthesized by DCC and acyl chloride method

2.2 目標(biāo)化合物A～E 的結(jié)構(gòu)表征:

化合物A 白色結(jié)晶;mp.37.1～37.6 ℃;IR(KBr)νmax1683.77(-C=O)，1756.43(-C=O)cm–1;1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ:7.83 (1H，d，J=8.8 Hz，H-3＇)，7.33 (2H，d，J=8.1 Hz，H-3，H-5)，7.15 (2H，d，J=8.1 Hz，H-2，H-6)，6.81 (1H，dd，J=2.5 Hz，J=8.8 Hz，H-4＇)，6.47 (1H，d，J=2.5 Hz，H-6＇)，4.04 ［1H，m，-CH(CH3)COO-］，3.83 (3H，s，-OCH3)，2.49 ［2H，d，J=7.2 Hz，-CH2CH(CH3)2］，2.36 (s，3H，-COCH3)，1.88［1H，m，-CH(CH3)2］，1.67 (3H，d，J=7.2 Hz，-CH3)，0.92［6H，d，J=6.6 Hz，-(CH3)2］;ESI-MS［M +Na］+m/z 377.2 (calcd for C22H26O4，354.4)。

化合物B 白色固體;mp.36.5～37.5℃;IR(KBr)νmax1686.80(-C=O)，1756.43(-C=O)cm–1;1H-NMR (400 MHz，CDCl3)δ:7.81 (1H，d，J=7.7 Hz，H-3＇)，7.61 (1H，d，J=8.2 Hz，H-5＇)，7.46 (1H，t，J=7.9 Hz，H-6＇)，7.33 (2H，d，J=7.9 Hz，H-3，H-5)，7.23 (1H，dd，J=2.0 Hz，J=8.0，H-4＇)，7.18 (2H，d，J=7.9 Hz，H-2，H-6)，3.97［1H，q，J=7.1 Hz，-CH(CH3)COO-］，2.59(3H，s，-COCH3)，2.50［2H，d，J=7.2 Hz，-CH2CH(CH3)2］，1.88［1H，m，-CH(CH3)2］，1.64 (3H，d，J=7.1 Hz，-CH3)，0.93 ［6H，d，J=6.6 Hz，-(CH3)2］;ESI-MS［M +Na］+m/z 347.2 (calcd for C21H24O3，324.4)。

化合物C 黃色油狀物;IR (KBr)νmax1689.82(-C=O)，1762.49(-C=O)cm–1;1H-NMR (400 MHz，CDCl3)δ:7.77 (1H，d，J=7.8 Hz，H-4＇)，7.49 (1H，t，J=7.7 Hz，H-5＇)，7.33 (1H，d，J=8.0 Hz，H-2＇)，7.31 (2H，d，J=8.0 Hz，H-3，H-5)，7.17 (2H，d，J=7.9 Hz，H-2，H-6)，7.01 (1H，d，J=8.1 Hz，H-6＇)，4.02 ［1H，q，J=7.1 Hz，-CH(CH3)COO-］，2.50［2H，d，J=7.2 Hz，-CH2CH(CH3)2］，2.36 (s，3H，-COCH3)，1.88［m，1H，-CH(CH3)2］，1.67 (3H，d，J=7.2 Hz，-CH3)，0.92［6H，d，J=6.6 Hz，-(CH3)2］;ESI-MS［M +Na］+m/z 347.2 (calcd for C21H24O3，324.4)。

化合物D 黃色油狀物;IR (KBr)νmax1683.77(-C=O)，1759.46(-C=O)cm–1;1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ:7.32 (1H，d，J=8.0 Hz，H-3＇)，7.30 (2H，d，J=8.1 Hz，H-3，H-5)，7.17 (2H，d，J=7.9 Hz，H-2，H-6)，7.02 (1H，dd，J=3.0 Hz，J=8.9，H-6＇)，6.92 (1H，d，J=8.9 Hz，H-5＇)，4.00［1H，q，J=7.1 Hz，-CH(CH3)COO-］，3.83(3H，s，-OCH3)，2.48 ［2H，d，J=7.2 Hz，-CH2CH(CH3)2］，2.30 (3H，s，-COCH3)，1.88［1H，m，-CH(CH3)2］，1.67 (3H，d，J=7.1 Hz，-CH3)，0.91［6H，d，J=6.6 Hz，-(CH3)2］;ESI-MS［M +Na］+m/z 377.2 (calcd for C22H26O4，354.4)。

化合物E 黃色油狀物;IR (KBr)νmax1687.67(-C=O)，1754.26(-C=O)cm–1;1H-NMR (400 MHz，CDCl3)δ:7.33 (2H，d，J=7.8 Hz，H-3，H-5)，7.24 (1H，d，J=8.2 Hz，H-5＇)，7.17 (2H，d，J=7.8 Hz，H-2，H-6)，6.77 (1H，dd，J=2.2 Hz，J=8.3，H-6＇)，6.63 (1H，m，H-4＇)，6.58 (1H，d，J=8.0 Hz H-2＇)，3.95 ［1H，q，J=7.1 Hz，-CH(CH3)COO-］，3.79 (3H，s，-OCH3)，2.50 ［2H，d，J=7.2 Hz，-CH2CH(CH3)2］，1.90 ［1H，m，-CH(CH3)2］，1.63 (3H，d，J=7.1 Hz，-CH3)，0.94［6H，d，J=6.6 Hz，-(CH3)2］;ESI-MS［M +Na］+m/z 335.2 (calcd for C20H24O3，312.4)。

2.3 目標(biāo)化合物(A～E)的抗炎活性

A～E 對小鼠耳廓二甲苯致炎的抑制作用見表2。由表2 數(shù)據(jù)可以看出，A～E 的抗炎活性均強于模型對照CMC-Na 組和陽性對照布洛芬組。

化合物A～E 均為布洛芬的酯縮合產(chǎn)物，進入體內(nèi)后存在一個水解釋放的過程，到達最高有效的血藥濃度時間慢于布洛芬。而本文的抗炎活性測試均在給藥后1 h 進行，目標(biāo)化合物可能尚未完全水解。因此后期計劃進行目標(biāo)化合物的體內(nèi)釋放度的實驗，確定目標(biāo)化合物的釋放度與時間的關(guān)系，從而找出血藥濃度的達峰時間，進一步確認(rèn)化合物的抗炎活性強弱。至于布洛芬分子中羧基“隱藏”后對胃粘膜的損害是否減少，也將在后期進行實驗進一步確認(rèn)。

表2 目標(biāo)化合物對二甲苯致炎小鼠耳腫脹的影響(n=10，()Table 2 Effects of targeted compounds on ear-swelling of mice induced by xylene (n=10，()

表2 目標(biāo)化合物對二甲苯致炎小鼠耳腫脹的影響(n=10，()Table 2 Effects of targeted compounds on ear-swelling of mice induced by xylene (n=10，()

注:與CMC-Na 組比較，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01;與布洛芬組比較，＊＊P＜0.05Note:Compare with control，* P＜0.01，＊＊P＜0.01;Compare with ibuprofen，＊＊P＜0.05

1 Chinese Pharmacopoeia Commission (國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2000，193.

2 Kim HS，Kim AS，Lee JM，et al.A mixture of Trachelospermi caulis and Moutan cortexradicis extracts suppresses collageninduced arthritis in mice by inhibiting NF-(B and AP-1.J Pharm Pharmacol，2012，64(3):420-429.

3 Peng LH，Liu S，Xu SY，et al.Inhibitory effects of salidroside and paeonol on tyrosinase activity and melanin synthesis in mouse B16F10 melanoma cells and ultravivioletB-induced pigmentation in guigea pig skin.Phytomedicine，2013，20(12):1082-1087.

4 Zhang JZ(張競之)，Chen XY(陳小憶)，Jin WX(金偉孝)，et al.Effects of peaonol on activity and changes of HU-VEC-C in patients with blood stasis syndrome of hypertension.J Liaoning Univ TCM(遼寧中藥大學(xué)學(xué)報)，2012，14(6):29-31.

5 Fu PK，Wu CL，Tsai TH，et al.Anti-inflammatory and anticoagulative effects of paeonol on LPS-induced acute lung injury in rats.eCAM，2012，2012:1-12.

6 Kim SH，Kim SA，Park MK，et al.Paeonol inhibits anaphylactic reaction by regulating histamine and TNF-a.Int Immunopharmacol，2004，4(2):279-287.

7 Wang B，Yan G.Structure and antitumor(LOVO)activity of Cortex moutan heteroglycan and curcumin.Carbohydr Polym，2011，86:520-525.

8 Chen BD，Ning ML，Yang GS.Effect of paeonol on antioxidant and immune regulatory activity in hepatocellular carcinoma rats.Molecules，2012，17:4672-4683.

9 Chen BY(陳炳陽)，Yue RC(岳榮彩)，Liu F(劉芳)，et al.Acetophenones and antioxidant activity in Cynanchum auriculatum Royle ex Wight.J Pharm Sci，2013，31(5):351-354.

10 Laine L，Smith R，Min k，et al.Systematic review:the lower gastrointestinal adverse effects of non-steroidal anti-inflammatory drugs.Aliment Pharmacol Ther，2006，3(43):751-767.

11 Zhen YM(趙一玫)，Xia D(夏丹)，Ai CP(艾彩萍)，et al.Synthesis and anti-inflammatory activities of ibuprofen derivatives.Chin J Med Chem(中國藥物化學(xué)雜志)，2005，15(6):360-363.

12 Han YP(韓永萍)，Lu J(盧晶)，Zhang H(張歡)，et al.Study on the preparation of salicylate ester of chitooligosaccharide by DCC condensation method and its anti-bacterial function.Chem World(化學(xué)世界)，2011，3:155-159.

13 Ao GZ(敖桂珍).Studies on design，synthesis and anti-inflammatory activity of (-substituted p-methyl sulfonyl propenonic acid and related compounds.Nanjing:China Pharmaceutical University(中國藥科大學(xué))，PhD.2002.