紫球藻共生真菌產(chǎn)物中紫紅色色素的穩(wěn)定性及抗氧化性研究

程 文，許 偉，邵 榮，*

1常州大學(xué)石油化工學(xué)院，常州 213164;2 鹽城工學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，鹽城 224051

與人工合成色素相比，天然色素因其無(wú)毒、安全性高、色澤自然，且具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥理功能而日益受到重視［1］。天然色素一般來(lái)源于資源有限的動(dòng)植物［2-5］。研究表明，微生物也可作為天然色素的來(lái)源［6-8］。微生物生長(zhǎng)繁殖迅速，不受時(shí)間與空間的限制，可大規(guī)模生產(chǎn)，克服了動(dòng)植物資源有限的問(wèn)題［6］。色素的穩(wěn)定性是色素在應(yīng)用中的一個(gè)重要指標(biāo)，色素穩(wěn)定性的好壞將直接影響著色物質(zhì)的色澤和品質(zhì)［9］。但天然色素的穩(wěn)定性差，從而影響其應(yīng)用［10-12］。本課題組前期從紫球藻共生真菌中篩選獲得一株產(chǎn)天然紫紅色色素的菌株，該菌株通過(guò)液體發(fā)酵、提取、分離后得到紫紅色色素，初步研究表明該色素具有一定的開(kāi)發(fā)與利用價(jià)值。因此，本文對(duì)紫紅色色素的穩(wěn)定性和抗氧化性進(jìn)行了研究，為該色素的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

共生真菌，從紫球藻(Porphyridium purpureum)中篩選獲得。該菌株于2013 年9 月保藏于中國(guó)微生物保藏中心(北京)，保藏號(hào)為8168，經(jīng)鑒定為刀孢蠟蚧菌(Lecanicillium psalliotae)［13］。采用該菌進(jìn)行液體發(fā)酵，所得發(fā)酵液產(chǎn)物經(jīng)濃縮、提取分離后獲得紫紅色色素。

1.1.2 試劑

乙醇、正丁醇、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、抗壞血酸、檸檬酸、亞硫酸鈉、30%雙氧水(均為分析純，購(gòu)自江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司);ABTS［＞98%色譜純，購(gòu)自Sigma-aldrich(上海)貿(mào)易有限公司］;鄰菲啰啉(分析純，購(gòu)自上海山浦化工有限公司);其它試劑均為分析純，并用蒸餾水配制溶液。

1.1.3 儀器

UV2310II 紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司);DZF-6050 真空干燥箱、DK-BD電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司);SHZ-IID循環(huán)水式真空泵、RE-2000B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司);AUY220 電子天平［島津國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司］;TGLL-18K 離心機(jī)(太倉(cāng)市華美生化儀器廠);PHS-3C 精密pH 計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色素的提取

菌株接種在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，于28℃靜置培養(yǎng)7～9 d。將發(fā)酵液抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至原體積的1/5。向濃縮液中加入3 倍體積的無(wú)水乙醇，4 ℃冷藏過(guò)夜，抽濾除去多糖、蛋白等不溶物;將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/10，用2 倍體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，此過(guò)程重復(fù)三次，將萃取的乙酸乙酯合并，加入無(wú)水硫酸鈉去除水分，過(guò)濾，將濾液真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，于真空干燥箱中干燥備用。

1.2.2 光譜掃描

取上述樣品溶于蒸餾水，以蒸餾水為對(duì)照，置于UV2310II 紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)下，在200～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，檢測(cè)最大吸收波長(zhǎng)，測(cè)得結(jié)果為520 nm，將其作為測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.3 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

將色素溶解于蒸餾水中進(jìn)行穩(wěn)定性研究，使對(duì)照組的吸光度在0.4～0.7 之間。

分別取樣品溶液5 mL 置于20、40、60、80、100℃的溫度下恒溫水浴處理1～3 h，每隔1 h 取出樣品，冷卻至室溫，測(cè)定其在520 nm 處的吸光度，計(jì)算色素殘存率，并分析不同溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響。

1.2.4 pH 對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

將樣品溶于pH 為2、4、6、8、10、12 的緩沖溶液中，室溫條件下，每隔1 h 測(cè)定其在520 nm 處的吸光度，計(jì)算色素殘存率，分析不同pH 對(duì)色素穩(wěn)定性的影響。

1.2.5 光照對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

分別取樣品溶液5 mL，置于室外日光、室內(nèi)散射光、紫外光及暗室條件下處理，每隔12 h 測(cè)定其在520 nm 處的吸光度，計(jì)算色素殘存率，分析不同光照條件對(duì)色素穩(wěn)定性的影響。

1.2.6 H2O2對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

將氧化劑H2O2分別配成終濃度為0.10%、0.25%、0.50%、1.00%的紫紅色色素溶液，以不加H2O2為對(duì)照(0.00%)，每隔2 h 測(cè)定其在520 nm處的吸光度，計(jì)算色素殘存率，分析氧化劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響。

1.2.7 Na2SO3對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

將還原劑Na2SO3配成終濃度為1.0、2.5、5.0、25.0、50.0 μg/mL 的色素溶液，以不加Na2SO3為對(duì)照，每隔2 h 測(cè)定其在520 nm 處的吸光度，計(jì)算色素殘存率，分析還原劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響。

1.2.8 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

分別將金屬離子Na+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Mg2+、K+配成終濃度為1.0、2.5、5.0 mmol/L的色素溶液，并以不添加金屬離子為對(duì)照，觀察色素顏色變化，室溫靜置每隔2 h 測(cè)定其在520 nm 處的吸光度，計(jì)算色素殘存率。

1.2.9 常用食品添加劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

分別將氯化鈉、氯化鉀、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、抗壞血酸、檸檬酸配成濃度為5.0 mmol/L 的色素溶液，并以不添加添加劑為對(duì)照，室溫靜置每隔2 h 測(cè)定其在520 nm 處的吸光度，計(jì)算色素殘存率，分析不同食品添加劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響。

1.2.10 色素對(duì)ABTS 自由基的清除能力

參照Cao 等［14］的方法并作略微修改來(lái)測(cè)定色素對(duì)ABTS 自由基的清除能力。將2.45 mmol/L 的過(guò)硫酸鉀加入到7.00 mmol/L 的ABTS 水溶液中，黑暗處理16 h，形成穩(wěn)定溶液。取適量上述溶液加水，調(diào)節(jié)溶液使其在734 nm 處的吸光度為0.700 ±0.01。取不同濃度的色素提取液150 μL，加入3 mL的ABTS 溶液，室溫下反應(yīng)6 min，測(cè)定734 nm 處的吸光度，以水作對(duì)照。ABTS·清除率的計(jì)算公式如下:

A0是以蒸餾水代替色素的吸光度，A1是加色素的吸光度。

1.2.11 色素對(duì)羥基自由基的清除能力

采用鄰二氮菲法對(duì)色素清除羥基自由基的能力進(jìn)行測(cè)定。1.0 mL 的鄰菲啰啉(2 mmol/L)，4.0 mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.0，0.2 mol/L)，1.0 mL 蒸餾水，1.0 mL 的FeSO4(2 mmol/L)，1.0 mL 的H2O2(2 mmol/L，現(xiàn)配現(xiàn)用)，振蕩混勻，在37 ℃水浴60 min，記作Bb;以1.0 mL 蒸餾水代替1.0 mL H2O2，其它條件同Bb處理，記作Bc;以1.0 mL 不同濃度的提取液代替1.0 mL 蒸餾水，其它條件同Bb處理，記作Bs。Bb、Bc、Bs的吸光度在510 nm 處測(cè)定。·OH 清除率的計(jì)算公式如下:

上述所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次(n=3)，并且標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于5% 。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

天然色素的熱穩(wěn)定性是其在工業(yè)中潛在應(yīng)用的重要指標(biāo)。該色素在20～100 ℃條件下吸光度值的變化如圖1 所示。由圖1 可知，色素在20～60 ℃條件下，溶液吸光度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而略有上升;80～100 ℃下，溶液吸光度值隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。加熱3 h 后，在20、30、60、80 ℃條件下?lián)p失低于1.0%，在100 ℃條件下?lián)p失率為8.9%。由此可知，該紫紅色色素具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖1 溫度對(duì)紫紅色色素穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of temperature on the stability of the amaranth pigments

2.3 pH 對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

圖2 顯示了在不同pH 溶液中色素吸光度的變化。由結(jié)果可知，中性和弱酸性的條件下，該色素表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，色素在堿性條件下顏色由紫紅色變?yōu)闇\灰色，殘留率低于50%。該研究結(jié)果為紫紅色色素在食品加工以其他應(yīng)用中提供一定的理論依據(jù)。

圖2 pH 對(duì)紫紅色色素穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of pH on the stability of the amaranth pigments

2.4 光照對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

如圖3 所示，考察了色素在不同光照條件下的穩(wěn)定性。在室內(nèi)自然光、紫外光和避光條件下色素?fù)p失較小，96 h 后殘留率均高于85.00%;而在室外直射光照射24 h 后，色素有效成分損失顯著，殘留率僅為33.60%，96 h 后色素顏色褪去為無(wú)色。結(jié)果顯示，室內(nèi)散射光、紫外光和避光對(duì)色素穩(wěn)定性無(wú)明顯影響，而太陽(yáng)光對(duì)色素的穩(wěn)定性有顯著影響。因此，該色素在應(yīng)用保存過(guò)程中應(yīng)避免太陽(yáng)光的直射。

圖3 光照對(duì)紫紅色色素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of light on the stability of the amaranth pigments

2.5 H2O2對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

圖4 H2O2對(duì)紫紅色色素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of H2O2on the stability of the amaranth pigments

天然色素通常可以被氧化或還原成另一種化學(xué)結(jié)構(gòu)［15］。氧化劑H2O2對(duì)紫紅色色素的影響，結(jié)果如圖4 所示。隨著H2O2濃度的增加，色素的殘存率降低，且在2 h 內(nèi)色素有效成分明顯減少，處理時(shí)間越長(zhǎng)，色素殘留量越少。結(jié)果表明，氧化劑H2O2對(duì)色素的穩(wěn)定性有顯著影響。

2.6 Na2SO3對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

由圖5 可知，隨著還原劑Na2SO3濃度、反應(yīng)時(shí)間的增加，紫紅色色素吸光度增加。當(dāng)濃度低于10 μg/mL 時(shí)，增色作用明顯;濃度高于10 μg/mL 時(shí)，增色作用趨于平緩。結(jié)果顯示，還原劑Na2SO3對(duì)色素具有增色作用。

圖5 Na2SO3對(duì)紫紅色色素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of Na2SO3on the stability of the amaranth pigments

表1 金屬離子對(duì)紫紅色素穩(wěn)定性的影響Table 1 Effect of metal ions on the stability of the amaranth pigments

2.7 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

由表1 可知，不同濃度的金屬離子Na+、K+、Ca2+、Mg2+對(duì)紫紅色色素穩(wěn)定性影響不大，而加入Zn2+使色素顏色明顯變淺，Cu2+、Fe3+使色素顏色變?yōu)樽厣?。由結(jié)果可知，該色素對(duì)Zn2+、Cu2+、Fe3+敏感，對(duì)其他多種常見(jiàn)金屬離子穩(wěn)定性良好。

2.8 常用食品添加劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

如圖6 所示，在溶液中分別加入氯化鈉、氯化鉀、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和淀粉，色素吸光度無(wú)明顯變化;而加入檸檬酸或抗壞血酸后，溶液吸光度明顯減小，這可能是因?yàn)榧尤胨嵝晕镔|(zhì)時(shí)溶液酸性增強(qiáng)，從而使色素不穩(wěn)定，這與pH 對(duì)色素的影響相一致。結(jié)果表明鹽類(lèi)和糖類(lèi)食品添加劑對(duì)色素具有護(hù)色作用，酸性添加劑不利于色素的穩(wěn)定。

圖6 食品添加劑對(duì)紫紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of food additives on the stability of the amaranth pigments

2.9 色素清除ABTS 自由基的能力

ABTS 試驗(yàn)是基于抗氧化劑清除穩(wěn)定的ABTS自由基能力的測(cè)定。如圖7 所示，隨著色素濃度(0.8～12.5 mg/mL)的增加，清除ABTS 自由基的能力增強(qiáng)。在濃度為12.5 mg/mL 時(shí)，色素對(duì)ABTS自由基的清除率達(dá)到99.69%。由此可知，該色素明顯含有抗氧化劑，并顯示了很強(qiáng)的清除ABTS 自由基的能力。

圖7 紫紅色素對(duì)ABTS 自由基的清除能力Fig.7 ABTS radical scavenging activity of the amaranth pigments

2.10 色素清除羥基自由基的能力

如圖8 所示，隨著色素濃度(2.5～12.5 mg/mL)的增加，對(duì)羥基自由基的清除能力增強(qiáng)。當(dāng)達(dá)到12.5 mg/mL 時(shí)，其清除率達(dá)到80.95%。結(jié)果顯示，該色素具有一定清除羥基自由基的能力。

圖8 色素對(duì)羥基自由基的清除能力Fig.8 Hydroxyl radical scavenging activity of the amaranth pigments

3 結(jié)論

本文通過(guò)分光光度法考察了紫球藻共生真菌發(fā)酵產(chǎn)物中紫紅色色素的穩(wěn)定性，并進(jìn)一步研究了該色素抗氧化能力。此色素具有一定的耐熱性，可高溫(80 ℃)加熱，色素在中性和弱酸性條件下穩(wěn)定，鹽類(lèi)、糖類(lèi)食品添加劑以及金屬離子K+、Na+、Ca2+、Mg2+對(duì)色素穩(wěn)定性無(wú)明顯影響。而太陽(yáng)光、氧化劑會(huì)使色素褪色，Cu2+、Fe3+使色素變色，影響其穩(wěn)定性，在加工應(yīng)用中應(yīng)避免這些因素。同時(shí)，該色素還具有抗氧化能力，色素能顯著地清除ABTS和羥基自由基，清除率分別達(dá)到99.69% 和80.95%。該紫紅色色素含有多種成分，需進(jìn)一步分離、鑒定;另外可對(duì)該菌產(chǎn)色素的條件進(jìn)行優(yōu)化，為該菌應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)。

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