近紅外漫反射光譜法快速測定當(dāng)歸中阿魏酸及亞油酸

顧志榮，張亞亞，丁軍霞，王亞麗*，孫宇靖

1甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實驗中心;2 甘肅中醫(yī)學(xué)院當(dāng)歸研究所，蘭州 730000

當(dāng)歸［Angelica sinensis (Oliv.)Diels］為傘形科多年生草本植物，主產(chǎn)于甘肅定西及隴南一帶，云南、湖北亦有栽培［1］。現(xiàn)代研究表明，揮發(fā)油、有機(jī)酸及多糖［2］是其最主要的藥效組分。當(dāng)歸中有機(jī)酸主要有阿魏酸、亞油酸、煙酸等［3］。阿魏酸具有抗氧化、清除自由基以及抗紫外線等作用，其含量是2010 年版中國藥典中當(dāng)歸質(zhì)量控制的特征性指標(biāo)［4］，多用HPLC 進(jìn)行測定。但該法前處理復(fù)雜、儀器操作繁瑣、分析時間較長，且阿魏酸在水中穩(wěn)定性差，見光、受熱極易分解，易與當(dāng)歸中阿魏酸松柏酯相互轉(zhuǎn)化［5］。亞油酸是人體無法合成的必須脂肪酸，其功能性多不飽和鍵具有降低血清膽固醇的作用［6］，但其在空氣中易發(fā)生自氧化。

NIR 是正在迅速發(fā)展的一種綠色分析技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、化工、煙草、制藥和食品工程等領(lǐng)域［7］。NIR 兼?zhèn)淞丝梢妳^(qū)光譜分析信號容易獲取與紅外區(qū)光譜分析信息量豐富兩方面的優(yōu)點，但也有譜帶重疊多、吸收強(qiáng)度低等缺點，在定量分析中必需在一定波段內(nèi)利用化學(xué)計量學(xué)方法建立數(shù)學(xué)模型，才能確定成分含量與光譜間的關(guān)系［8］。本研究首先采用RP-HPLC 測得當(dāng)歸藥材中阿魏酸與亞油酸的含量值，然后采用NIR 對當(dāng)歸藥材在近紅外光譜區(qū)域的特征吸收進(jìn)行實驗研究，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化定量校正模型，實現(xiàn)當(dāng)歸藥材中阿魏酸與亞油酸含量的快速、準(zhǔn)確測定。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑及主要儀器

145 批當(dāng)歸藥材，采集于甘肅及云南14 個縣級主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院晉玲教授鑒定為Angelica sinensis (Oliv.)Diels。

阿魏酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:131187-100504);亞油酸對照品(美國迪瑪公司，批號:245-12-06);甲醇(色譜純，山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司)，超純水(自制，電阻率≥18.2 MΩ)。

Nicolet-6700 型傅立葉變換近紅外光譜儀(配有積分球模塊、RESULT 3.0 光譜采集軟件和TQ Analyst 8.0 化學(xué)計量學(xué)軟件，美國Thermo 公司);Agilent 1100 LC/DAD 系統(tǒng)(包括G1312A 二元梯度洗脫泵，G1316A柱溫箱，G1315B DAD檢測器，G1313A 進(jìn)樣器和Agilent 化學(xué)工作站，美國Agilent公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品NIR 光譜的采集

將當(dāng)歸樣品粉碎，過50 目篩，預(yù)先置于紅外燈下干燥至恒重。采集條件:積分球漫反射方式，掃描范圍10000～4000 cm-1，掃描32 次，分辨率8 cm-1，溫度20 ℃，空氣相對濕度70%，以空氣為參比，每批樣品重復(fù)采集3 次，取平均光譜。

1.2.2 異常光譜的剔除

利用TQ Analyst 8.0 化學(xué)計量學(xué)軟件中的Dixon 檢驗剔除異常光譜。

1.2.3 阿魏酸及亞油酸含量的測定

采用RP-HPLC 測定當(dāng)歸中阿魏酸及亞油酸的含量，作為建立模型的化學(xué)參考值。精密稱取樣品粉末約0.5 g，加70%甲醇20 mL，超聲(15 ℃，800 W，50 kHz)提取45 min，濾過，上清液定容至25 mL容量瓶中，進(jìn)樣前用0.45 μm 微孔濾膜過濾。色譜條件:Waters X-Bridge C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)色譜柱，以水(A)-甲醇(B)為流動相進(jìn)行梯度洗脫(0～5 min，10%～20% B;5～15 min，20%～50% B;15～35 min，50%～80% B;35～55 min，80%～90% B)，體積流量0.8 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL，柱溫30 ℃，阿魏酸及亞油酸的檢測波長分別為280 nm 及206 nm。方法學(xué)考察顯示所采用的儀器及方法誤差符合要求。每份樣品平行測定3 次，取平均值。以外標(biāo)法計算2 種成分的含量。

1.2.4 近紅外光譜模型的建立

利用PLS(偏最小二乘法)建立當(dāng)歸中阿魏酸及亞油酸的定量校正模型。以隨機(jī)選擇的30%的樣品作為驗證集，其余70%作為校正集。以相關(guān)系數(shù)(R)、校正均方差(RMSEC)、預(yù)測均方差(RMSEP)和交叉驗證均方差(RMSECV)作為評價校正模型優(yōu)劣的指標(biāo)［7］。采用交叉驗證法驗證所建模型的穩(wěn)健性，采用獨(dú)立的驗證集對所建模型的預(yù)測能力進(jìn)行檢驗。通過TQ Analyst 8.0 化學(xué)計量學(xué)軟件的自動優(yōu)化功能結(jié)合樣品近紅外光譜圖篩選建模波段。采用內(nèi)部交互驗證法(internal cross-validation)篩選潛變量個數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 當(dāng)歸樣本的近紅外光譜特征分析

145 批當(dāng)歸樣本的近紅外原始光譜見圖1。一階導(dǎo)數(shù)光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜見圖2、圖3。由圖可見，一階導(dǎo)數(shù)光譜能夠清楚地反映出樣品中的主要吸收峰位，而二階導(dǎo)數(shù)光譜反而將噪聲放大。一階導(dǎo)數(shù)光譜中的主要特征峰:6896 cm-1為O-H 的一級倍頻吸收峰，6079 cm-1為C-H 的一級倍頻吸收峰，5352 cm-1為C=O 的二級倍頻吸收帶，5000 cm-1為O-H 的合頻吸收峰，4545 cm-1為N-H 的合頻吸收峰，4347 cm-1為C-H 的合頻吸收帶［9，10］。

圖1 145 批當(dāng)歸樣本近紅外原始光譜圖Fig.1 Original NIR spectra of 145 batches of samples

圖2 經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)處理后的光譜圖Fig.2 The spectra processed by first derivation

圖3 經(jīng)二階導(dǎo)數(shù)處理后的光譜圖Fig.3 The spectra processed by second derivation

2.2 樣品集的劃分及化學(xué)參考值測定結(jié)果

Dixon 檢驗剔除了4 個異常光譜，從剩余的141批樣品中隨機(jī)抽取42 批作為驗證集，用于檢驗?zāi)Ｐ偷念A(yù)測能力，其余99 批作為校正集，用于建立模型。對照品及當(dāng)歸樣品的HPLC 色譜圖見圖4，樣品集中阿魏酸及亞油酸的含量分布見表1。由表1 可知，阿魏酸和亞油酸的含量分布范圍較廣，具有很好的代表性，能夠滿足建模的要求。

圖4 混合對照品(A)與當(dāng)歸樣品(B)的HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of mix standards (A)and sample (B)

表1 樣品中阿魏酸及亞油酸的含量分布Table 1 Content distribution of ferulic acid and linolic acid of samples

2.3 光譜波段的篩選

由圖1 可見，不同當(dāng)歸樣本的NIR 譜圖十分接近，無法直接判定各成分含量與個別波長點的吸光度之間的相關(guān)性，必須在一定的區(qū)間內(nèi)建立數(shù)學(xué)模型來確定近紅外光譜和成分含量之間的關(guān)系［11，12］。結(jié)合TQ Analyst 8.0 定量分析軟件的自動優(yōu)化結(jié)果和樣品紅外光譜圖，選定阿魏酸的建模區(qū)間為7502.4～6799.9 及4456.85～4246.32 cm-1波段，亞油酸的建模區(qū)間為8724.7～5000 及4427.9～4246.7 cm-1波段。此區(qū)間信息量豐富，能充分反映出樣品的性質(zhì)和組成，避免了采用全譜建模的大量計算。

2.4 光譜預(yù)處理方法的選擇

為減少噪聲、信號本底、基線漂移、樣品顆粒不均勻以及光散射等對光譜的干擾，保證模型的可靠性和準(zhǔn)確性，本實驗在阿魏酸及亞油酸的分析譜區(qū)間內(nèi)，分別考察了未處理光譜(None)、一階導(dǎo)數(shù)光譜(FD)、二階導(dǎo)數(shù)光譜(SD)，以及一階導(dǎo)數(shù)光譜、二階導(dǎo)數(shù)光譜與多元散射校正(MSC)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量校正(SNV)、Savitsky-Golay(SG)平滑和Norris 導(dǎo)數(shù)濾波平滑相結(jié)合的方法。結(jié)果見表2?？芍?，選用一階導(dǎo)數(shù)和Savitzky-Golay 平滑以及多元散射校正和對光譜進(jìn)行預(yù)處理所得模型的預(yù)測效果最佳。

表2 不同光譜預(yù)處理方法的建模結(jié)果Table 2 The results of different spectra preprocessing methods

2.5 潛變量個數(shù)的確定

采用PLS 建立定量模型，潛變量個數(shù)(factor)的選擇對模型預(yù)測能力的影響較大。潛變量個數(shù)太多，所建模型包含太多的測量噪音，出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象;潛變量個數(shù)太少，導(dǎo)致建模信息不全，模型預(yù)測能力差［13］。由圖5 及圖6 可知，隨著潛變量個數(shù)的增加，R2(%)不斷增加，RMSECV 不斷減小，當(dāng)阿魏酸及亞油酸的潛變量個數(shù)分別達(dá)到5 和4 后都趨于穩(wěn)定。

圖5 阿魏酸模型的潛變量個數(shù)與RMSECV 及R2 的關(guān)系Fig.5 Factor relationship with RMSECV and R2 of ferulic acid model

圖6 亞油酸模型的潛變量個數(shù)與RMSECV 及R2 的關(guān)系Fig.6 Factor relationship with RMSECV and R2 of linolic acid model

2.6 定量模型的建立及評價

綜合上述分析，本實驗選定阿魏酸的建模區(qū)間為7502.4～6799.9 及4456.85～4246.32 cm-1波段，亞油酸的建模區(qū)間為8724.7～5000 及4427.9～4246.7 cm-1波段，采用Savitzky-Golay 平滑、多元散射校正和一階導(dǎo)數(shù)相結(jié)合對光譜進(jìn)行預(yù)處理，阿魏酸及亞油酸的潛變量個數(shù)分別取5 和4，由此建立PLS 定量模型。由相關(guān)圖(圖7)可見，模型預(yù)測值與參考方法測得的真實值之間具有較好的相關(guān)性。所建阿魏酸模型的R 為0.9721，RMSEC 為0.5942，RMSEP 為0.6747;采用交叉驗證法判斷阿魏酸模型的穩(wěn)健性，交叉驗證R 為0.9364，RMSECV 為1.0244。所建亞油酸模型的R 為0.9673，RMSEC為0.4573，RMSEP 為1.0682;采用交叉驗證法判斷亞油酸模型的穩(wěn)健性，交叉驗證R 為0.8925，RMSECV 為1.2236。由此可見，所建模型比較理想。

以驗證集樣品的近紅外光譜預(yù)測值與HPLC 測定值的比值作為預(yù)測回收率［14］。通過定量校正模型，驗證集樣品中阿魏酸含量的預(yù)測值在0.23～2.54 mg/g 之間，百分偏差在-7.69%～9.88%之間，平均百分偏差1.98%，預(yù)測回收率在92.31%～109.88%之間，平均預(yù)測回收率101.98%;驗證集樣品中亞油酸含量的預(yù)測值在0.013～0.297 mg/g之間，百分偏差在-5.00%～11.67%之間，平均百分偏差1.34%，預(yù)測回收率在95.00%～111.67%之間，平均預(yù)測回收率102.03%。上述結(jié)果表明，驗證集樣品中阿魏酸與亞油酸含量的預(yù)測值分布范圍與真實值基本相符，平均百分偏差均較小，平均預(yù)測回收率均在100%附近，因此利用近紅外漫反射光譜技術(shù)快速測定當(dāng)歸中阿魏酸與亞油酸的含量是可行的。

3 結(jié)論與展望

圖7 阿魏酸及亞油酸的定量校正模型所得預(yù)測值與真實值之間的相關(guān)圖Fig.7 Correlation between actual content and predicted content of ferulic acid and linolic acid

本研究采集全國14 個當(dāng)歸主產(chǎn)縣共145 批當(dāng)歸藥材進(jìn)行NIR 光譜采集，建立PLS 數(shù)學(xué)模型對阿魏酸和亞油酸行含量測定，結(jié)果令人滿意。與常規(guī)HPLC、GC 等含量測定方法相比，本法樣品預(yù)處理簡單、操作簡便、快速無損、準(zhǔn)確可靠，可以節(jié)省大量的分析時間，特別適合大量樣品及在某些條件下不穩(wěn)定樣品的快速測定，在中藥及復(fù)方制劑中質(zhì)量控制成分的快速檢測和質(zhì)量評價中具有廣闊的發(fā)展前景［15］。同時，本法作為一種間接測定含量的方法，其準(zhǔn)確性受化學(xué)參考值、樣本量及其代表性、儀器因素以及人為因素等的影響。首先，建模樣本的收集和準(zhǔn)備非常重要，樣本集各種化學(xué)成分的含量范圍必須涵蓋所有可能遇到的樣本中相應(yīng)組分的含量范圍，且含量要盡可能分布均勻。中藥化學(xué)成分極其復(fù)雜，只能通過收集足夠多的樣本來盡量涵蓋實際分析中可能遇到的各種樣品［16］。其次，化學(xué)參考值盡量要選取準(zhǔn)確度與靈敏度較高的經(jīng)典方法進(jìn)行測定，增加所建模型的可靠性。只有這樣，才可通過直接掃描待測樣品的近紅外光譜圖并立刻獲得樣本中相應(yīng)成分的含量。

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