亳芍總生物堿提取及抑菌活性的研究

陳乃東，朱旺生，楊小東

1皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，六安 237012;2皖西中藥與天然藥物工程技術(shù)研究中心，六安 237012;3安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230032

亳芍(Bozhou Peony Paeonia lactiflora)，即亳白芍，主產(chǎn)安徽省亳州地區(qū)，為安徽道地藥材之一，是芍藥科植物芍藥(Paeonia lactiflora)或其變種毛果芍藥(Paeonia trichocarpa)栽培品的根，夏秋季采挖其根部，去凈泥土和支根，沸水浸或略煮至受熱均勻，再經(jīng)曬干等處理后即炮制成中藥亳芍，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗氧化、抗驚厥、護(hù)肝等作用，對胃腸道疾病和心血管疾病也有一定的療效［1-3］。植物化學(xué)研究表明，白芍主要含有單萜［4］、倍半萜及三萜［5］、單寧［6］、揮發(fā)油［7］、黃酮［8］、多酚類［9］、多糖［10］等活性成分。

在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，亳芍中含有微量生物堿［11］。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，以烏頭堿為標(biāo)準(zhǔn)品，采用紫外分光光度法測定生物堿的含量，對亳芍總生物堿的最佳提取工藝條件及其抑菌活性進(jìn)行研究，為后續(xù)的亳芍生物堿深度藥理學(xué)研究和開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料、儀器和試劑

1.1 材料

實驗材料亳芍購于安徽省亳州市，品種經(jīng)皖西學(xué)院陳乃東博士鑒定為亳芍(Radix Paeoniae Alba)。

1.2 儀器

GJ14-DGF3006 型電熱恒溫干燥箱(金壇市榮華儀器制造有限公司)，HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市國華電器有限公司)，RE-52D 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海浦滬儀器廠)，F(xiàn)A-1004 型電子天平(上海精科天平廠)，超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，滅菌鍋(上海三申醫(yī)療器械有限公司)，TU-1901 雙光束紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)。

1.3 試劑

氨水、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、濃鹽酸、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、硫酸鎂、葡萄糖、硫酸二氫鉀、淀粉等均為國產(chǎn)分析純。

標(biāo)準(zhǔn)品烏頭堿購自城都吉歐特生物科技有限公司，純度≥98%(HPLC 檢測)。

1.4 供試菌種

金黃色葡萄球菌(Staphyloccus aureus)，大腸桿菌(Escherichia coli)，酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，黑曲霉菌(Aspergillu nigers)由植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心內(nèi)生真菌研究室汪學(xué)軍副教授提供。

2 實驗方法

2.1 亳芍總生物堿的提取

2.1.1 總生物堿提取方法

稱取100g 干燥至恒重的亳芍粉末，分別在不同條件下(乙醇濃度、料液比、提取液鹽酸、提取溫度)進(jìn)行回流提取，過濾，濾液減壓濃縮至干獲總生物堿粗提物。將亳芍生物堿粗提物以5%(V/V)鹽酸捏溶，等體積二氯甲烷萃取萃三次除雜，酸水相中緩慢滴加氨水至溶液pH=8.5～9.5(精密pH 試紙測定)，等體積氯仿萃取三次，減壓回收氯仿，得亳芍總生物堿。

2.1.2 總生物堿含量測定方法

亳芍總生物堿的含量測定參照陳美川等［12，13］方法改進(jìn)而來，操作步驟如下:

2.1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液的配制

精密稱取烏頭堿對照品5 mg 置50 mL 容量瓶中，加0.01 mol/L 鹽酸溶液使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

2.1.2.2 醋酸-醋酸鈉緩沖液及溴甲酚綠溶液的配制

取0.2 moI/L 醋酸溶液250 mL，用0.20 mol/L醋酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至3.1 10 mL，備用。取溴甲酚綠50 mg，加0.50 mol/L 氫氧化鈉液1.6 mL 研磨使溶解，加水至100 mL，用三氯甲烷提取3 次，每次30 mL，棄去三氯甲烷液，備用。

2.1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法

精密量取烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mL 分別置分液漏斗中，各依次加入0.01 mol/L 鹽酸溶液2.00、1.75、1.50、1.25、1.00、0.50、0.00 mL，各精密加醋酸-醋酸鈉緩沖液10 mL、漠甲酚綠液2 mL、三氯甲烷10 mL，振搖3 min，靜置，分取三氯甲烷液，于412 nm 處測定吸光度值(A)。然后以吸光度為縱坐標(biāo)(y)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為:y=0.410x-0.009(R2=0.9940)。

2.1.2.4 亳芍總生物堿的含量測定

0.01mol/L 鹽酸溶液配制0.1 mg/mL 總生物堿提取物溶液，按測定標(biāo)準(zhǔn)曲線相同方法測定亳芍生物堿的含量。

2.1.3 亳芍生物堿提取條件的優(yōu)化

2.1.3.1 單因素實驗

從溫度、乙醇濃度、料液比、提取時間四個方面探討影響亳芍總生物堿提取率的因素。其中，溫度考察范圍為:40、50、60、70、80 ℃;乙醇濃度考察范圍:30%、50%、70%、90%、100%;料液比考察范圍:1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40;提取時間考察范圍:1、2、3、4、5 h。提取次數(shù)均為一次。當(dāng)考察其中一個因素時，其它因素選擇五個水平中的中位數(shù)，例如，考察溫度影響時，另三個條件分別選擇:70%乙醇濃度、料液比1∶20、提取時間3 h。

2.1.3.2 正交實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇合適的因素水平，進(jìn)行4 因素3 水平正交實驗。

2.2 抑菌活性的測定

培養(yǎng)大腸桿菌與金黃色葡萄球菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)酵母菌、黑曲霉菌采用PDA 培養(yǎng)基。

2.2.1 樣品配制

精密配制2.5、5.0、10.0、15.0 mg/mL 亳芍總生物堿乙酸乙酯溶液各5 mL，密封，備用。以2.5 μg/mL 青霉素和克霉唑乙酸乙酯溶液為陽性對照、乙酸乙酯為陰性對照。

2.2.2 菌懸液的制備

供試菌種斜面培養(yǎng)基活化后，取適量用生理鹽水稀釋，制成菌懸液備用。

2.2.3 抑菌活性測定——濾紙片法

在無菌操作臺上將滅菌后的固體培養(yǎng)基，每皿精確加入0.5 mL 菌液，涂布棒涂布均勻。將直徑8 mm 的濾紙圓片滅菌后在不同濃度生物堿提取液中浸泡2 h 后取出，貼于平板上，以無菌水作為對照。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，黑曲霉菌和酵母于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。上述實驗每組設(shè)3 個重復(fù)，測定濾紙片的抑菌圈直徑大小，記錄實驗結(jié)果。

3 實驗結(jié)果

3.1 亳芍總生物堿提取工藝單因素試驗結(jié)果

單因素實驗結(jié)果如圖1 所示。液料比1∶20，提取時間為3 h，提取溫度為60 ℃條件時，分別以30%、50%、70%、90%、100%濃度的乙醇進(jìn)行回流提取，隨乙醇濃度的增加測得的生物堿含量也升高(圖1A)，表明總生物堿的提取率隨乙醇濃度的增高而增加，當(dāng)濃度超過70%時，提取率下降，可能是亳芍中水溶性總生物堿在高濃度醇中溶解度下降所致，故選擇50%、70%、90%為繼續(xù)優(yōu)化提取條件的乙醇濃度。

當(dāng)提取時間為3 h、提取溫度為60 ℃、乙醇濃度為70%，考察料液比對總生物堿提取的影響，實驗結(jié)果見圖1B。實驗測定的生物堿含量(提取率)隨料液比的增加而增加，當(dāng)料液比超過1∶20 時，生物堿得率增加緩慢。但料液比越小，耗費的試劑越多，后處理工作量增大，綜合考慮，選擇料液比1∶10～1∶30，作為進(jìn)一步優(yōu)化提取條件的料液比考察范圍。

溫度對總生物堿提取的影響如圖1C 所示，采用70%乙醇、料液比1∶20 提取3 h 時，隨著溫度的升高，總生物堿提取率增加，當(dāng)溫度達(dá)60 ℃時，提取率最高，然后隨著溫度的升高生物堿的提取率下降。故實驗選擇50、60、70 ℃作為進(jìn)一步優(yōu)化提取條件的溫度范圍。

提取時間對總生物堿提取的影響見圖4，隨提取時間的升高，總生物堿提取率增加，而時間為3 h時，隨著時間推移，提取率增加緩慢，故選2、3、4 h為作為進(jìn)一步優(yōu)化提取條件的時間范圍。

圖1 乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取溫度(C)及提取時間(D)對亳芍總生物堿提取率的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration (A)，solid-liquid ratio (B)，extraction temperature (C)and extraction time (D)on the extraction yield of total alkaloids from Bozhou Peony P.lactiflora

3.2 提取工藝優(yōu)化

通過單因素實驗，確定了每個因素的三個水平(表1)，以L9(43)正交實驗設(shè)計對亳芍總生物堿提取工藝進(jìn)行優(yōu)化(表2)。

由表2 可知影響亳芍生物堿提取因素中，對生物堿提取率影響由大到小依次為:提取溫度(D)＞提取時間(C)＞乙醇濃度(A)＞料液比(B)，提取亳芍總生物堿的最佳提取工藝條件為A1B2C2D2，即乙醇濃度為60%，料液比為1∶20，提取時間為3 h，提取溫度為60 ℃，在此條件下，測得亳芍總生物堿含量為0.58‰。

表1 正交因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiments

表2 正交實驗與結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments

3.3 不同濃度的亳芍總生物堿抑菌效果

不同濃度的亳芍總生物堿抑菌活性如表3 所示，亳芍總生物堿對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金色葡萄球菌和酵母菌均表現(xiàn)出抑菌活性(圖2)，且生物堿提取液濃度與抑菌圈大小具有量效關(guān)系，抑菌圈隨生物堿提取液濃度增大而擴(kuò)大，對金黃色葡萄球菌、黑曲霉抑菌效果尤為顯著。

4 結(jié)論

亳芍生物堿的最佳提取工藝為:60%乙醇，提取溫度為60 ℃，提取時間為3 h，料液比為1∶20。亳芍總生物堿提取物對大腸桿菌、酵母菌、黑曲霉菌及金色葡萄球菌均表現(xiàn)出一定的體外抑菌活性，抑菌作用由大到小依次為:金色葡萄球菌＞黑曲霉菌＞酵母菌＞大腸桿菌本研究結(jié)果可為中藥亳芍質(zhì)量控制、藥理學(xué)研究及資源開發(fā)提供參考依據(jù)。

表3 亳芍生物堿的體外抑菌活性Table 3 Antibacterial activity of different concentrations of total alkaloids from Bozhou Peony P.lactiflora

圖2 亳芍總生物堿提取物的抑菌效果Fig.2 Antibacterial effects of total alkaloids from Bozhou Poeny P.lactiflora

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