白木香內(nèi)生真菌Botryosphaeria rhodina A13 固體發(fā)酵產(chǎn)物的分離鑒定

張 瑤，陶美華，陳玉嬋，郁建平，章衛(wèi)民*

1貴州大學(xué)，貴陽 550025;2 廣東省微生物研究所 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070

內(nèi)生真菌(endophytic fungi)通常是指生長在健康植物體根、莖、葉等組織細(xì)胞間隙或者細(xì)胞內(nèi)對(duì)植物體沒有明顯病害的真菌，是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分［1］。近年來研究表明，植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生多種結(jié)構(gòu)類型的活性代謝產(chǎn)物［2］。來源于藥用植物的內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生和宿主植株相同或者相似的生物活性物質(zhì)，因此藥用植物內(nèi)生真菌是發(fā)現(xiàn)天然活性物質(zhì)的重要資源。

據(jù)報(bào)道，葡萄座腔菌屬真菌Botryosphaeria rhodina 能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的抗菌和抗腫瘤活性代謝產(chǎn)物［3，4］。本研究前期從藥用植物白木香［Aquilaria sinensis (Lour.)Gilg.］中分離獲得一株內(nèi)生真菌Botryosphaeria rhodina A13［5］，經(jīng)離體實(shí)驗(yàn)表明，該菌株能誘導(dǎo)離體白木香樹枝產(chǎn)生沉香倍半萜組分5，9-二甲基-2-(1-甲基亞乙基)-環(huán)癸醇［6］。為了研究該株內(nèi)生真菌的活性代謝產(chǎn)物，本研究以白木香木屑為培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)菌株A13 進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)，并對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，從中分離得到10 個(gè)化合物，分別鑒定為:豆甾-4-烯-3-酮(1)、豆甾-5-烯-3β-醇-7-酮(2)、豆甾-4-烯-3，6-二酮(3)、(22E，24S)-5α，6α-環(huán)氧基-24-甲基膽甾-8(14)，22-二烯-3β，7α-二醇(4)、5，4＇-二羥-7-甲氧基黃酮(5)、香草酸(6)、對(duì)甲氧基苯甲酸(7)、尿嘧啶(8)、2-甲氧基對(duì)苯二酚(9)、2-甲基-3，5-羥基色酮(10)。所有化合物均為首次從該屬真菌中分離得到。

1 材料與儀器

1.1 菌株和細(xì)胞株

內(nèi)生真菌B.rhodina A13 分離自30 年生的白木香［5］，供試腫瘤細(xì)胞株為乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460，均保藏于廣東省微生物菌種保藏中心。

1.2 試劑

柱色譜硅膠(100～200 目、200～300 目，青島海洋化工廠)、GF254高效薄層硅膠板(Merck 公司)，C18反相硅膠(40～75 μm，F(xiàn)uji Silysia Chemical Ltd.)，凝膠Sephadex LH-20(18～110 μm，Amersham Biosciences Ltd.)，其余試劑均為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠。

1.3 儀器

LRH-100 生化培養(yǎng)箱(韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司)，AVANCE III 型500 MHz 核磁共振波譜儀(Bruker 公司)，API 2000 LC/MS/MS 質(zhì)譜儀(MDS SCIEX 公司)，DSQII 型電子轟擊電離質(zhì)譜儀(美國Thermo 公司)，LC-20AT 型高效液相色譜儀(日本島津公司)，ZF-6 型三用紫外線分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)，Hangping FA2004N 電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，RE-2000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，超凈工作臺(tái)(上海恒益科技有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)

在白木香木屑中加入適量水拌勻，使含水量達(dá)60%左右，分裝至聚丙烯食用菌袋，每袋約裝100 g木屑，共100 袋，121 ℃滅菌30 min，冷卻后挑取適量B.rhodina A13 菌絲體接種于菌袋中，在黑暗條件下27 ℃培養(yǎng)38 d。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的提取與分離

將固體發(fā)酵產(chǎn)物用95%乙醇浸提3 次，濃縮得發(fā)酵物提取物，加入適量水懸浮，先用石油醚萃取5次，至上層液澄清，40 ℃下減壓濃縮，得浸膏26.7 g，再用乙酸乙酯萃取5 次，至上層液澄清，40 ℃下減壓濃縮，得浸膏71.1 g。兩種浸膏分別過硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，用薄層色譜(TLC)檢測(顯色劑為茴香醛-濃硫酸試劑)，合并相似組分，石油醚萃取部分得到39 個(gè)組分(P1～P39)，乙酸乙酯部分得到39 個(gè)組分(E1～E39)。P11 組分用甲醇反復(fù)重結(jié)晶得到化合物1(18.0 mg)。重結(jié)晶后P11 剩余組分經(jīng)Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，正相硅膠柱(石油醚-乙酸乙酯4∶1)，制備薄層色譜得化合物2(1.6 mg)。P14 組分經(jīng)Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，用甲醇反復(fù)重結(jié)晶得到化合物3(2.0 mg)。P30 組分經(jīng)Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，反相硅膠柱層析(甲醇-水70∶30)，正相硅膠柱(石油醚-乙酸乙酯2∶1～1∶2 和乙酸乙酯)，制備薄層色譜得化合物4(20.0 mg)。E23 組分經(jīng)Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫得到亞組分E23-3～E23-4，E23-3 組分用甲醇反復(fù)重結(jié)晶得化合物5(1.0 mg)，E23-4 組分經(jīng)反相硅膠柱層析(甲醇-水40∶60)得化合物6(5.5 mg)。E15 組分經(jīng)Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，反相硅膠柱層析(甲醇-水30∶70)，用甲醇反復(fù)重結(jié)晶得化合物7(1.3 mg)。E34 組分經(jīng)Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，用甲醇反復(fù)重結(jié)晶得化合物8(1.5 mg)。E25 組分經(jīng)Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，反相硅膠柱層析(甲醇-水20∶80)，制備薄層色譜得化合物9(2.0 mg)。E21組分經(jīng)Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，反相硅膠柱層析(甲醇-水20∶80)，用甲醇反復(fù)重結(jié)晶，制備薄層色譜得化合物10(5.2 mg)。

2.3 細(xì)胞毒活性測定

采用SRB 法［7］測定化合物4 的細(xì)胞毒活性。取對(duì)數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460，用胰酶消化，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力大于95%后，用新鮮培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為3 ×104個(gè)/mL，細(xì)胞接種于96 孔板，每孔加入180 μL 的細(xì)胞懸液，并設(shè)3 個(gè)空白孔調(diào)零，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，每孔加入20 μL 待測樣品，空白(陰性)對(duì)照加20 μL 培養(yǎng)基，以順鉑作陽性對(duì)照。置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h 后，加入50 μL 50%冷三氯醋酸固定細(xì)胞，4 ℃放置1 h 后用蒸餾水洗滌5 次，空氣中自然干燥。然后每孔加入由1%冰醋酸配制的濃度為4 mg/mL 的SRB 溶液100 μL，室溫中染色30 min，去上清，用1%冰醋酸洗滌5 次，空氣干燥。最后每孔加入濃度為10 mmol/mL 的Tris 溶液200 μL，用酶標(biāo)儀測定570 nm 處的吸光值(A)，用以下公式計(jì)算樣品對(duì)細(xì)胞生長的抑制率，采用SigmaPlot 10.0 軟件計(jì)算IC50值。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色晶體;ESI-MS m/z:413 ［M +H］+，分 子 式 為C29H48O。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ:5.72 (1H，s，H-4)，1.18 (3H，s，H-19)，0.92 (3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.86 (3H，t，J=7.5 Hz，H-29)，0.84 (3H，d，J=6.8 Hz，H-27)，0.82 (3H，d，J=6.8 Hz，H-26)，0.71 (3H，s，H-18);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δ:200.6 (C-3)，172.6 (C-5)，124.6 (C-4)，56.9 (C-14)，56.8 (C-17)，54.7 (C-9)，46.7 (C-24)，43.3 (C-13)，40.5(C-12)，39.5 (C-10)，37.0 (C-20)，36.6 (C-1)，36.5 (C-8)，34.9 (C-22)，34.8 (C-7)，33.9 (C-6)，33.0 (C-23)，30.0 (C-2)，29.1 (C-25)，26.9(C-16)，25.1 (C-15)，24.0 (C-28)，21.9 (C-11)，20.7 (C-27)，19.9 (C-19)，19.6 (C-21)，18.3 (C-26)，12.9 (C-18)，12.9 (C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［8］，確定其結(jié)構(gòu)為豆甾-4-烯-3-酮。

化合物2 白色粉末;EI-MS m/z:428 ［M］+，分子式為C29H48O2。1H NMR (500 MHz，MeOD)δ:6.14 (1H，s，H-6)，4.33 (1H，m，H-3)，1.30 (2H，m，H-28)，1.23 (3H，s，H-19)，0.97 (3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.89 (3H，t，J=7.5 Hz，H-29)，0.88 (3H，d，J=6.8 Hz，H-27)，0.85 (3H，d，J=6.8 Hz，H-26)，0.77 (3H，s，H-18);13C NMR (125 MHz，MeOD)δ:202.0 (C-7)，175.4 (C-5)，119.7(C-6)，68.6 (C-3)，56.9 (C-14)，56.5 (C-17)，54.8 (C-9)，46.8 (C-24)，43.1 (C-13)，41.9 (C-4)，40.4 (C-12)，39.8 (C-10)，36.9 (C-1)，36.9(C-20)，34.9 (C-8)，34.5 (C-22)，34.0 (C-2)，29.7 (C-25)，28.8 (C-16)，26.6 (C-23)，24.7 (C-15)，23.6 (C-28)，21.6 (C-11)，19.7 (C-26)，18.9(C-27)，18.7 (C-21)，18.0 (C-19)，11.8 (C-29)，11.8 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［9］，確定其結(jié)構(gòu)為豆甾-5-烯-3β-醇-7-酮。

化合物3 白色固體;EI-MS m/z:426 ［M］+，分子式為C29H46O2。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ:6.18 (1H，d，J=0.86 Hz，H-4)，1.17 (3H，s，H-19)，0.95 (3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.87 (3H，t，J=7.5 Hz，H-29)，0.85 (3H，d，J=6.8 Hz，H-27)，0.85 (3H，d，J=6.8 Hz，H-26)，0.73 (3H，s，H-18);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δ:203.3 (C-6)，200.5 (C-3)，162.0 (C-5)，126.4 (C-4)，57.5 (C-17)，56.8 (C-14)，51.9 (C-8)，47.7 (C-7)，46.7(C-24)，43.4 (C-13)，40.7 (C-10)，40.0 (C-12)，36.9 (C-20)，36.4 (C-1)，35.1 (C-8)，34.9 (C-2)，34.7 (C-22)，30.0 (C-25)，28.9 (C-16)，26.9(C-23)，24.9 (C-15)，24.0 (C-28)，21.8 (C-11)，20.7 (C-26)，19.9 (C-27)，19.6 (C-21)，18.4 (C-19)，12.9 (C-29)，12.8 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［10］，確定其結(jié)構(gòu)為豆甾-4-烯-3，6-二酮。

化合物4 白色固體;ESI-MS m/z:451 ［M +Na］+，分子式為C28H44O3。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ:5.23 (1H，m，H-23)，5.21 (1H，m，H-22)，4.43 (1H，d，J=3.6 Hz，H-7)，3.96 (1H，m，H-3)，3.15 (1H，d，J=3.6 Hz，H-6)，2.36 (1H，m，H-9)，2.12 (1H，m，H-20)，1.87 (1H，m，H-24)，1.03 (3H，d，J=6.9 Hz，H-21)，0.93 (3H，d，J=6.9 Hz，H-24＇)，0.88 (3H，s，H-18)，0.87 (3H，s，H-19)，0.85 (3H，d，J=7.0 Hz，H-27)，0.83 (3H，d，J=7.0 Hz，H-26);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δ:153.5 (C-14)，136.2 (C-22)，133.2 (C-23)，126.1(C-8)，69.6 (C-3)，68.7 (C-5)，66.0 (C-7)，62.2(C-6)，57.7 (C-17)，43.9 (C-24)，43.7 (C-13)，40.5 (C-20)，40.2 (C-9)，39.6 (C-4)，37.5 (C-12)，36.7 (C-10)，34.0 (C-25)，33.1 (C-1)，32.0(C-2)，28.1 (C-16)，25.9 (C-15)，22.1 (C-21)，20.9 (C-24＇)，20.6 (C-26)，19.9 (C-27)，19.0 (C-11)，18.5 (C-18)，17.4 (C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［11］，確定其結(jié)構(gòu)為(22E，24S)-5α，6α-環(huán)氧基-24-甲基膽甾-8(14)，22-二烯-3β，7α-二醇。

化合物5 黃色固體;ESI-MS m/z:285 ［M +H］+，分子式為C16H12O5。1H NMR (500 MHz，DMSO)δ:12.96 (1H，s，5-OH)，10.39 (1H，s，4＇-OH)，7.96 (2H，m，H-2＇，6＇)，6.93 (2H，m，H-3＇，5＇)，6.85 (1H，s，H-3)，6.77 (1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，6.37 (1H，d，J=2.2 Hz，H-6)，3.86 (3H，s，7-OCH3);13C NMR (125 MHz，DMSO)δ:183.3 (C-4)，166.5 (C-7)，165.4 (C-2)，162.7 (C-4＇)，162.6(C-5)，158.6 (C-8a)，129.9 (C-2＇，6＇)，122.4 (C-1＇)，117.3 (C-3＇，5＇)，106.0 (C-4a)，104.4 (C-3)，99.3 (C-6)，94.1 (C-8)，57.4 (7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［12］，確定其結(jié)構(gòu)為5，4＇-二羥基-7-甲氧基黃酮。

化合物6 白色粉末;EI-MS m/z:168 ［M］+，分子式為C8H8O4。1H NMR (500 MHz，DMSO)δ:7.45 (1H，s，H-2)，7.41 (1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，6.79 (1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，3.77 (3H，s，-OCH3);13C NMR (125 MHz，DMSO)δ:151.5 (C-4)，148.3 (C-3)，124.5 (C-6)，116.1 (C-2)，114.3(C-5)，56.8 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［13］，確定其結(jié)構(gòu)為香草酸。

化合物7 白色粉末;ESI-MS m/z:151 ［MH］-，分子式為C8H8O3。1H NMR (500 MHz，MeOD)δ:7.97 (2H，d，J=8.9 Hz，H-2，6)，6.94 (2H，d，J=8.9 Hz，H-3，5)，3.85 (3H，s，-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［14］，確定其結(jié)構(gòu)為對(duì)甲氧基苯甲酸。

化合物8 黃色固體;ESI-MS m/z:113 ［M +H］+，111 ［M-H］-，分子式為C4H4N2O2。1H NMR(500 MHz，DMSO)δ:11.01 (1H，br s)，10.82 (1H，br s)，7.38 (1H，d，J=7.6 Hz，H-6)，5.44 (1H，d，J=7.6 Hz，H-5);13C NMR (125 MHz，DMSO)δ:165.7 (C-1)，152.9 (C-3)，143.6 (C-5)，101.6 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［15］，確定其結(jié)構(gòu)為尿嘧啶。

化合物9 黃色粉末;ESI-MS m/z:304 ［2M +Na+H］+，320 ［2M+K+H］+，分 子 式 為C7H8O3。1H NMR (500 MHz，MeOD)δ:7.58 (1H，d，J=1.2 Hz，H-3)，7.50 (1H，d，J=8.2 Hz，H-6)，6.77 (1H，dd，J=8.2，1.2 Hz，H-5)，3.89(3H，s，-OCH3);13C NMR (125 MHz，MeOD)δ:150.0 (C-4)，147.7 (C-2)，128.6 (C-1)，123.9 (C-6)，114.8 (C-5)，113.5 (C-3)，55.8 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［16］，確定其結(jié)構(gòu)為2-甲氧基對(duì)苯二酚。

化合物10 無色油狀液體;ESI-MS m/z:193［M-H］-，分子式為C10H10O4。1H NMR (500 MHz，CD3OD)δ:7.58 (1H，dd，J=7.5，8.4 Hz，H-7)，7.08 (1H，d，J=7.5 Hz，H-8)，6.94 (1H，dd，J=8.3，0.8 Hz，H-6)，4.56 (2H，m，H-2，H-3)，1.47(3H，d，J=6.3 Hz，CH3-2);13C NMR (125 MHz，CD3OD)δ:169.7 (C-4)，162.4 (C-5)，143.6 (C-8a)，137.3 (C-7)，117.3 (C-6)，117.2 (C-8)，107.5 (C-4a)，81.1 (C-2)，69.0 (C-3)，17.7 (C-2a)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［17］，確定其結(jié)構(gòu)為2-甲基-3，5-羥基色酮。

3.2 細(xì)胞毒活性

細(xì)胞毒活性測試結(jié)果表明，化合物4 對(duì)腫瘤細(xì)胞株MCF-7 和NIC-H460 的IC50分別為34.22 μg/mL 和37.97 μg/mL(表1)。

表1 化合物4 對(duì)2 種腫瘤細(xì)胞株的IC50值Table 1 IC50values of compound 4 against two tumor cell lines

4 討論

葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)真菌是農(nóng)林業(yè)上重要的病原菌、內(nèi)生真菌或潛在的致病菌，能產(chǎn)生具有細(xì)胞毒活性、抗菌活性等次級(jí)代謝產(chǎn)物［3，4］。如黃玖利從海南粗榧內(nèi)生真菌葡萄座腔菌S15 的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到具有抑制人慢性髓原白血病細(xì)胞K562 活性的化合物［18］。本研究從藥用植物白木香內(nèi)生真菌B.rhodina A13 的固體發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定了10 個(gè)化合物，它們均為首次從該屬真菌中分離得到。化合物5 為黃酮類化合物，具有抗口腔表皮樣癌細(xì)胞KB 作用，此化合物的多個(gè)衍生物具有顯著的抗KB 細(xì)胞和抑制DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶I 活性［12］?；衔?～4 是甾體類化合物，活性測試結(jié)果表明化合物4 有細(xì)胞毒活性。

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