一種新型的高效液相色譜填料

李心怡，谷曉娟，孫孔春，姚艷云，沈報(bào)春*

1昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500;2 楚雄醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，楚雄 675005

近年來，新型液相色譜分離模式和固定相的研究非?；钴S，鍵合硅膠固定相已成為近代液相色譜發(fā)展的主流。新型鍵合固定相分子設(shè)計(jì)、合成、性能、應(yīng)用及分離機(jī)理研究是當(dāng)今高效液相色譜法領(lǐng)域內(nèi)的重要課題。隨著分離對(duì)象的越來越多樣性和復(fù)雜性，對(duì)傳統(tǒng)的十八烷基硅烷化硅膠(ODS)色譜固定相提出了巨大挑戰(zhàn)，發(fā)展基于超分子作用或π-酸和π-堿多個(gè)作用位點(diǎn)的高效液相硅膠色譜固定相成為近年來色譜分離材料研究中的熱點(diǎn)之一［1，2］。

研究表明，天然化合物獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其具有作為色譜配體的能力，能用于相似結(jié)構(gòu)物質(zhì)的分離富集，并且由于其具有天然、低毒或無毒性質(zhì)，人工合成配體無法達(dá)到這種效果［3，4］。薯蕷皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在多個(gè)活潑的羥基和雙鍵，用其制備成固定相能與溶質(zhì)產(chǎn)生氫鍵作用、偶極-偶極作用、π-π 作用等多種作用。三七［Panax notoginseng (Burk.)F.H.Chen］是五加科植物，以干燥的根入藥，有散瘀止血，消腫止痛的功效［5］。三七中含有多種人參皂苷以及與人參皂苷類似的成分［6］，其主要藥理活性成分為三七總皂苷(Panax notoginseng saponins，PNS)［7］。以三七總皂苷為原料藥的制劑也不斷涌現(xiàn)。為了有效打擊假劣藥品，保證藥品質(zhì)量，同時(shí)為了實(shí)現(xiàn)中藥標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)化，推動(dòng)中藥材GAP 的實(shí)施，建立三七總皂苷原料藥及其制劑的質(zhì)量控制方法勢在必行。

本實(shí)驗(yàn)以薯蕷皂苷為原料，采用“一鍋法”，制備得到一種新型的高效液相色譜填料——薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相。對(duì)該固定相進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，采用不同的溶質(zhì)探針對(duì)新固定相的色譜性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，并建立三七總皂苷原料藥進(jìn)行HPLC 指紋圖譜，可用于其質(zhì)量控制。該研究不僅擴(kuò)大了薯蕷皂苷的應(yīng)用范圍，對(duì)天然產(chǎn)物中活性成分的分離分析也提出了新的思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津LC-2010A 高效液相色譜儀，島津SPDM10AVP 檢測器;裝柱機(jī):Haskel 氣動(dòng)高壓裝柱機(jī)(Haskeline.，Burbank，USA);空柱管(250 mm ×4.6 mm):大連日普利科技儀器有限公司;元素分析儀(VarioEL，德國);固體核磁共振儀(德國Bruker 公司);S-3000N 電子掃描顯微鏡(日本日立公司);TGS 系列熱重分析儀(北京博淵精準(zhǔn)科技發(fā)展有限公司)。

Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 × 250 mm，5 μm);l，6-己二異氰酸酯(1，6-diisocyanatehexane，99%，Acros Organics);硅膠(青島美高化工有限公司，平均粒徑5 μm，平均孔徑92 ?，比表面積260 m2/g);乙腈，甲醇(江蘇漢邦科技有限公司，色譜純)，水(三次重蒸水)，其余試劑均為分析純。色譜評(píng)價(jià)所用試劑均購于中國試劑網(wǎng)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

薯蕷皂苷(南京春秋生物工程有限公司，98%);三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd(成都普菲德生物技術(shù)有限公司);三七總皂苷原料藥(批號(hào):120801、120805、120807、120901、120909、120911、120916、121003、121007、121008)由云南云科藥業(yè)提供。

1.2 薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相的制備

1.2.1 薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相的合成

薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相的制備反應(yīng)式見圖1。具體實(shí)驗(yàn)步驟為:冰浴中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，向50 mL 3.0 g 硅烷化硅膠的干燥甲苯中加入1，6-己二異氰酸酯(2.5 mL，15 mmol)，攪拌15 min。移去冰浴，混合物加熱至70 ℃反應(yīng)2 h，冷卻至室溫后，氮?dú)獗Ｗo(hù)下除去多余溶劑。將10 mL 干燥甲苯分3 次洗滌，除掉過量的1，6-己二異氰酸酯。然后加入100 mL 含0.5 g 薯蕷皂苷的干燥吡啶溶液，將反應(yīng)化合物加熱至70 ℃，攪拌12 h 至薯蕷皂苷反應(yīng)完全。冷卻至室溫后過濾，分別用50 mL 的吡啶、水、甲醇、乙腈和二氯甲烷洗滌，減壓干燥(70 ℃，0.1 mbar，2 h)，得到薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相。

圖1 薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相合成路線Fig.1 Synthetic routes of dioscin-bonded silica gel stationary phase

1.2.2 薯蕷皂苷鍵合硅膠色譜柱的制備

將3.30 g 的薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相分散到50 mL 的氯仿-丙酮(1∶1，v/v)溶液中，超聲分散。用50 mL 針筒注入勻漿罐內(nèi)，勻漿罐接至裝柱機(jī)上，乙醇做頂替液，用6000 psi(約4.15 ×107Pa)壓力下裝入不銹鋼空柱中，頂替液成線形流出，維持高壓30 min，然后撤去壓力。待壓力表指針讀數(shù)降為零時(shí)，取下裝填好的色譜柱，用小刀削平填料，兩端密封，貼好標(biāo)記及流動(dòng)相方向待用。柱效用聯(lián)苯測定。

1.3 三七總皂苷原料藥的指紋圖譜分析

流動(dòng)相:乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫程序:0～42 min，14%A;42～69 min，14%～33%A;69～79 min，33%A;79～80 min，33%～90% A;80～110 min，90%A。流速:0.8 mL/min，柱溫:35 ℃，檢測波長:203 nm，進(jìn)樣量15 μL。

分別精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd 對(duì)照品適量，用甲醇溶解，制得濃度分別為0.87、3.89、0.44、0.86、1.2 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

分別取不同批號(hào)的三七總皂苷原料藥約100 mg，精密稱定，置于25 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。進(jìn)樣前取適量溶液用0.45 μm 微孔濾膜過濾。

2 結(jié)果與討論

2.1 薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相的結(jié)構(gòu)表征

固體核磁共振和紅外光譜可以提示固定相的結(jié)構(gòu);元素分析可根據(jù)相關(guān)元素的百分含量，計(jì)算出鍵合量;熱重分析則能用于估算固定相有機(jī)物總濃度，其掃描曲線與配體穩(wěn)定性有關(guān);電鏡掃描可由鍵合前后硅膠顆粒表層的改變，判斷鍵合成功與否。

2.1.1 固定相的固體核磁分析

薯蕷皂苷鍵合前后的13C 固體核磁圖譜見圖2。從圖2 可以看出，薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相的13C 固體核磁圖譜(圖2 B)比硅烷化硅膠的13C 固體核磁圖譜(圖2 A)多出兩簇峰，化學(xué)位移是δ:160 和δ:158，推測為=C-、C=O 基團(tuán)的信號(hào)峰。此外，硅烷化硅膠的-CH2(δ:25、δ:43)信號(hào)在鍵合上薯蕷皂苷配體后，出現(xiàn)偏移、信號(hào)增強(qiáng)，歸因于與薯蕷皂苷配體在此的信號(hào)峰(-CH2，-CH，-C-O)發(fā)生重疊。

2.1.2 固定相的紅外光譜分析

圖2 硅烷化硅膠及薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相的13C 固體核磁圖譜Fig.2 The solid-state 13C NMR of silylanization silica gel(A)and dioscin-bonded silica gel stationary phase(B)

硅烷化硅膠紅外光譜中，3455 cm-1提示分子結(jié)構(gòu)中有N-H 基團(tuán)，表明硅膠已經(jīng)發(fā)生硅烷化;薯蕷皂苷鍵合硅膠的紅外光譜比硅烷化硅膠的紅外光譜多出三組峰:在2940 cm-1多出一個(gè)C-H 伸縮振動(dòng)吸收峰，1642 cm-1，1570 cm-1提示有C=C，C=O 基團(tuán)。這些數(shù)據(jù)表明薯蕷皂苷已經(jīng)鍵合至硅烷化硅膠表面。

2.1.3 固定相的元素分析

硅烷化硅膠和薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相的元素分析結(jié)果見表1。與硅烷化硅膠相比，薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相的C、N、H 的含量均有增加。以含C量計(jì)算，薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相表面配體濃度為127.6 μmol/g。

表1 元素分析結(jié)果Table 1 Elemental analysis results

2.1.4 固定相的熱重分析

熱重分析結(jié)果顯示，隨著溫度的逐漸升高，硅膠表面的有機(jī)物發(fā)生分解，當(dāng)溫度升至176.9 ℃時(shí)，薯蕷皂苷固定相產(chǎn)生明顯的失重。薯蕷皂苷固定相在溫度達(dá)到176 ℃以后才開始失重，說明薯蕷皂苷固定相具有較好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，這為其穩(wěn)定的色譜性能奠定了基礎(chǔ)。

2.1.5 固定相的電鏡掃描分析

從硅膠、薯蕷皂苷固定相的電子顯微鏡掃描圖(圖3)可明顯觀察到，鍵合前后硅膠顆粒的表層形態(tài)存在明顯差異。鍵合前硅膠顆粒的表面光滑圓潤，鍵合后硅膠顆粒表面變得粗糙不平，表面被一層物質(zhì)覆蓋。結(jié)合固定相的元素分析和熱重分析可知，薯蕷皂苷已成功鍵合到硅膠上。

2.2 柱效與穩(wěn)定性考察

以聯(lián)苯為溶質(zhì)探針，甲醇-水(65∶35，v/v)為流動(dòng)相，流速設(shè)為0.4 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長設(shè)為254 nm，測得理論塔板數(shù)為4558 塊/米。采用甲醇交替沖洗一個(gè)月，聯(lián)苯保留時(shí)間、理論塔板數(shù)變化很小，說明該固定相上的薯蕷皂苷配體在流動(dòng)相中是穩(wěn)定的。

圖3 正相硅膠固定相(A)和薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相(B)的電鏡掃描圖Fig.3 The scanning electron microscope of silica gel stationary phase (A)and dioscin-bonded silica gel stationary phase (B)

2.3 三七總皂苷原料藥的指紋圖譜分析

指紋圖譜分析是對(duì)中藥及其制劑進(jìn)行宏觀分析的可行手段［8］。以人參皂苷Re 為參照峰(S)，確定16 個(gè)共有峰，對(duì)10 批三七總皂苷原料藥進(jìn)行指紋圖譜分析，建立了三七總皂苷原料藥在薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相上的指紋圖譜。

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的一致性，結(jié)果表明各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜1.40%，相對(duì)峰面積的RSD＜2.42%，結(jié)果表明方法精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品6 份，精密稱定，制成供試品溶液，分別進(jìn)樣，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的一致性，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.74%，相對(duì)峰面積的RSD＜2.93%，結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，室溫放置，分別于0、4、8、12、16、24 h 進(jìn)樣，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的一致性，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1.42%，相對(duì)峰面積的RSD＜2.90%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 指紋圖譜的建立

用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(中國藥典委員會(huì)2004A 版)處理10 批三七總皂苷原料藥色譜圖，生成對(duì)照譜圖(R)(見圖4);共標(biāo)定了16 個(gè)共有峰(占總面積90%以上)，共有峰在10 批藥材中相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1.36%，10 批樣品相似度分別為0.993、0.984、0.985、0.995、0.984、0.992、0.990、0.996、0.987、0.992。

以O(shè)DS 商品柱在相同的色譜條件下測定三七總皂苷原料藥，發(fā)現(xiàn)樣品的人參皂苷Rg1和Re 未能獲得分離;其次，72～82 min 內(nèi)的峰分離情況不理想;第三，人參皂苷Rd 在90 min 采集時(shí)間內(nèi)不能被洗脫。三七總皂苷原料藥在ODS 柱上的高效液相色譜圖見圖5。

與ODS 柱相比，薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相在同條件下，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd 均能達(dá)到基線分離;72～82 min 內(nèi)，獲得基線分離的色譜峰數(shù)目更多;人參皂苷Rd 的保留時(shí)間在68 min 左右，且90 min 內(nèi)，樣品色譜峰洗脫完全。

4 10 批次三七總皂苷原料藥樣品的高效液相色譜疊加圖Fig.4 Overlaid HPLC chromatograms of 10 batches of PNS APIs

圖5 三七總皂苷原料藥樣品在ODS 商品柱上的高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of PNS API on commercial ODS C18 column

3 結(jié)論

以天然產(chǎn)物藥用成分薯蕷皂苷為原料，制備得到一種新型的高效液相色譜填料——薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相。經(jīng)固體核磁共振、紅外光譜分析、電鏡掃描、熱重分析等技術(shù)確證，薯蕷皂苷已鍵合至硅膠表面并具有一定的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，由元素分析結(jié)果計(jì)算得出薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相表面配體濃度為127.6 μmol/g。采用自制的薯蕷皂苷鍵合硅膠色譜柱，乙腈-水梯度洗脫，建立了三七總皂苷原料藥指紋圖譜，為三七總皂苷原料藥質(zhì)量控制方法提供技術(shù)支持。與商品柱ODS 相比，薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相在分離人參皂苷Rg1、人參皂苷Re 時(shí)表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢;72～82 min 內(nèi)，獲得基線分離色譜峰數(shù)目更多;并在較短時(shí)間內(nèi)完成樣品分離分析。薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相的研制，為高效液相色譜固定相材料的尋找提供了新的方向，也為天然產(chǎn)物中活性成分的分離分析提供了新的思路。

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