滇重樓的psbA-trnH 條形碼分子鑒定研究

劉 濤 ，趙英良，楊 瑩，王 玲，李 瑪，王欣林，周 博，楊生超*

1云南農(nóng)業(yè)大學(xué);2 云南中煙工業(yè)有限責任公司，昆明 650201

重樓屬(Paris L.)隸屬于百合科(Liliaceae)，全屬共28 種，均為多年生草本，分布于歐亞大陸的熱帶及溫帶地區(qū)［1］。該屬是一個有著重要經(jīng)濟價值的植物類群，藥用歷史悠久，但藥用重樓的基源一直比較混亂，本屬蚤休亞屬(Paris subg.Daiswa sensus)的所有種類均具有粗壯的根狀莖［1］。為澄清藥用重樓基源混亂的問題，李恒對《滇南本草》等古籍文獻進行考證，表明藥用重樓應(yīng)以滇重樓(Pairs polyphylla Smith var.yunnanensis ［Franch.］Hand-Mazz)為正品，其它種類均為代用品［2］。

滇重樓(P.polyphylla)為多年生草本植物，味苦，有小毒，具有清熱解毒、消腫止痛之功效，具有抗腫瘤、止血、止咳平喘、抗菌、抗病毒等作用，也可用于療瘡癰腫、咽喉腫痛、驚風(fēng)抽搐的治療，是很多中成藥如宮血寧膠囊、三七血傷寧膠囊和清熱解毒片等著名中成藥的主要原料［3］。因滇重樓以根狀莖入藥，根據(jù)形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)等特征難以對正品及代用品進行區(qū)分，使得在藥材的收購及工廠化生產(chǎn)中無法將滇重樓與其它種區(qū)別開來;鑒于不同種類的重樓在藥用成分甾體皂甙的種類、含量等方面存在顯著的差異［4］，滇重樓及代用品的混用將給中醫(yī)用藥醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)的質(zhì)量控制帶來了極大的隱患。因此，對滇重樓及其代用品的鑒定方法和手段進行研究，摸索一套在藥材收購和生產(chǎn)中行之有效的鑒定方法，對于醫(yī)藥生產(chǎn)的質(zhì)量控制及保護重樓屬植物中的珍惜、瀕危種類有著重要的意義。

對于滇重樓的藥材的鑒定目前主要還是利用傳統(tǒng)的形態(tài)鑒別方式，盡管也有學(xué)者利用滇重樓中皂甙類物質(zhì)進行藥材品質(zhì)的判斷依據(jù)，但由于滇重樓的藥理作用并非僅僅由單一成分決定，同時各品種所含皂甙類化學(xué)成分及含量有較大差別，因此僅用皂甙類物質(zhì)鑒別藥材的品質(zhì)和真?zhèn)我膊痪呖陀^性。分子方面，張金渝等利用RAPD 技術(shù)從植物系統(tǒng)分類的角度對重樓屬中的4 種植物進行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)不同種類指紋圖譜有明顯的差異［5］;何俊等采用ISSR 技術(shù)對主要分布于云南的滇重樓不同居群進行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)不同居群的指紋圖譜也有明顯的差異，認為遺傳多樣性主要存在于居群間［6］;但由于有限的采樣數(shù)量和所采用分子標記的低分辨率，加之上述作者并未從分子鑒定的角度對滇重樓進行研究，因此重樓屬不同種類和居群的遺傳多樣性和分子鑒定還有待進一步的研究。

DNA 條形碼(DNA barcoding)技術(shù)以穩(wěn)定的基因組信息為依據(jù)，有望實現(xiàn)對物種鑒定的標準化［7，8］。但到目前為止，還沒有應(yīng)用DNA Barcoding技術(shù)對滇重樓進行分子鑒別，更沒有滇重樓的專用條形碼的報道。本實驗利用DNA Barcoding 技術(shù)對重樓屬下滇重樓進行分子鑒定。為重樓藥材的快速準確鑒定提供保障，也為臨床用藥安全奠定基礎(chǔ)。

1 實驗材料

本研究所用材料共12 個物種35 個樣品，包括試驗樣品及GenBank 下載序列。其中，滇重樓藥材樣品24 個(來自不同局群)，其余重樓種類樣品各1個。所有材料經(jīng)云南農(nóng)業(yè)大學(xué)何忠俊教授鑒定，憑證樣品保存于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院。實驗材料及序列的GenBank 登錄號見表1。

表1 本實驗中所采集的滇重樓樣本信息Table 1 Origins of P.polyphylla samples used in this study

2 實驗方法

2.1 樣本DNA 的提取

硅膠干燥樣品各0.5 g，液氮研磨，用植物基因組DNA 提取試劑盒(DNeasy Plant Mini Kit，QIAGEN)提取基因組DNA。

2.2 PCR 擴增及測序

引物為psbA/trnH 引物，引物psbA 的堿基序列:GTTATGCATGAACGTAATGCTC，下游引物trnH的堿基序列:CGCGCATGGTGGATTCACAAATC;樣本DNA 加入psbA/trnH 引物進行擴增，反應(yīng)熱循環(huán)程序為:94 ℃預(yù)變性5 min;然后進入循環(huán)，每個循環(huán)94 ℃變性30sec，54 ℃退火30 sec，72 ℃延伸90 sec，共30 個熱循環(huán)，最后延伸72 ℃延伸7min;4 ℃冷卻后取出;擴增反應(yīng)在PCR 儀上進行。PCR 反應(yīng)體系(25 μL):ddH2O 17.8 μL，10 × PCR buffer(Mg+2+Plus)2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)1.5 μL，Tag 酶(5 u/μL)0.2 μL，正向引物(10μmol/L)1 μL，反向引物(10 μmol/L)1 μL，模板DNA(50 ng/μL)1.0 μL。將擴增成功的PCR 產(chǎn)物(出現(xiàn)明顯PCR 條帶)進行純化后(采用上海生工核酸凝膠純化試劑盒)，送上海生工測序中心使用ABI3730XL測序儀(Applied Biosystems Co.，USA)雙向測序。RNA 酶、dNTP、PCR reaction buffer，均購自寶生生物公司。

2.3 數(shù)據(jù)處理和分析

測序峰圖采用序列拼接軟件Codoncode Aligner v2.06(CodonCode Co，USA)校對拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)，利用ClustalX v2.0 進行多序列比對并查錯。利用軟件MEGA5.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)分析比對［9］，并基于Kimura 2-parameter(K2P)模型進行種內(nèi)種間遺傳距離分析，用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹。利用BLAST 比對和NJ 樹對滇重樓及其同屬近緣種進行鑒定分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 基因組DNA 提取及PCR 擴增

提取的重樓樣品基因組DNA 電泳檢測顯示條帶主帶明顯，邊緣有彌散狀出現(xiàn)，說明DNA 有少部分降解。NanoDrop 檢測結(jié)果表明所提取基因組DNA 的A260/A280 值均處于1.6～1.8 間，且DNA濃度均較高(＞100 ng/μL)，說明樣品污染小，可作為PCR 反應(yīng)模版擴增。經(jīng)PCR 反應(yīng)，所有樣品的均顯示較亮條帶，可用于測序分析。PCR 擴增效率和測序成功率是評價DNA 條形碼序列的一個重要指標，實驗表明，psbA-trnH 片段在重樓屬植物中擴增非常容易，測序成功率高，適合做為重樓屬植物的條形碼序列。

3.2 滇重樓及其它種重樓psbA-trnH 序列分析

本研究中重樓藥材的psbA-trnH 序列分析表明，基于K2P 模型的遺傳距離分析，滇重樓種內(nèi)變異較小，其K2P 遺傳距離為0～0.018，平均K2P 遺傳距離為0.007，不同重樓種間變異較大，平均K2P 遺傳距離為0.025，滇重樓與其它種最小種間K2P 遺傳距離為0.040。種間最小遺傳距離明顯大于滇重樓的種內(nèi)最大遺傳距離。利用中藥材DNA 條形碼鑒定系統(tǒng)對滇重樓及其它重樓的序列進行比對，顯示所有地區(qū)的滇重樓在位點1-4 上的堿基都為CTGA，而其余重樓為AGAC;所有地區(qū)的滇重樓在位點19上的堿基缺失，而其余重樓為A;所有地區(qū)的滇重樓在位點77 上的堿基都為C，而其余重樓為T;所有地區(qū)的滇重樓在位點138 上的堿基都為C，而其余重樓為T;所有地區(qū)的滇重樓在位點792 上的堿基都為G，而其余重樓為T 或C;所有地區(qū)的滇重樓在位點1110-1113 上的堿基都為GGCG，而其余重樓為TCGA;所有地區(qū)的滇重樓在位點1116 上的堿基都為G，而其余重樓為T;所有地區(qū)的滇重樓在位點1119-1120 上的堿基都為CC，而其余重樓為TA、TG或GA。詳細情況見表2。通過這些滇重樓的DNA條形碼可以非常容易的對滇重樓進行鑒定。

表2 實驗樣本的psbA-trnH 片段信息位點統(tǒng)計情況Table 2 The informative sites statistics of psbA-trnH fragment in this experiment

基于psbA-trnH 序列構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)聚類樹見圖1，結(jié)果顯示，滇重樓單獨聚為一支，其近緣種聚為一支，表現(xiàn)出良好的單系性。因此，psbA-trnH 序列作為條形碼可快速準確鑒別滇重樓及其它重樓。理想的DNA 條形碼序列應(yīng)當具有明顯的種間變異，同時種內(nèi)變異足夠小。實驗表明，psbA-trnH 片段在滇重樓種內(nèi)變異幅度在0.0%～1.8%之間，而種間變異程度在4.0%～6.2%之間，因此該序列適合做為重樓屬植物的條形碼序列，且很容易將不同種重樓鑒別開來。

4 討論

圖1 基于psbA-trnH 序列構(gòu)建的NJ 樹Fig.1 NJ tree based on psbA-trnH sequences

近年來，由于DNA 分子標記技術(shù)在植物學(xué)中的廣泛應(yīng)用，使藥用植物的鑒別工作也取得了空前的發(fā)展。傳統(tǒng)的鑒定手段人為干擾因素較多，而DNA分子標記在中藥鑒別中不受生長發(fā)育階段、供試部位、環(huán)境條件的影響，能從分子水平上客觀地反映待測材料之間的差異，特別適合藥材近緣品種和道地藥材的鑒定。從國內(nèi)外研究狀況來看，由于DNA 分子標記技術(shù)能客觀反映物種間親源關(guān)系和遺傳多樣性，近年來，不少學(xué)者都已成功嘗試把它們用于藥用植物的鑒定。但這些分子標記技術(shù)往往表現(xiàn)出通用性低，可重復(fù)性不強的特點［10］。與其他分子鑒定方法相比，DNA 條形碼技術(shù)可使鑒定過程更加趨于標準化，在中藥鑒定領(lǐng)域中展示了廣闊的應(yīng)用前景［8］。

滇重樓是我國重要的民族中藥，因同屬重樓在形態(tài)上難以區(qū)分，使得在藥材的收購及工廠化生產(chǎn)中無法將滇重樓與其它種區(qū)別開來，給中醫(yī)用藥醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)的質(zhì)量控制帶來了極大的隱患。為了確保臨床用藥安全，本研究采用DNA 條形碼技術(shù)對中藥材滇重樓及同屬其他種進行鑒定研究。結(jié)果表明psbA-trnH 條形碼序列可有效鑒別滇重樓藥材，為滇重樓藥材鑒定的標準化奠定了基礎(chǔ)，具有重要的應(yīng)用和參考價值。

本研究為排除滇重樓不同產(chǎn)地個體間存在的變異信息，找到滇重樓特有的區(qū)別與其它重樓的信息位點，便從取樣策略上，廣泛采集了滇重樓所分布的區(qū)域，以此來確保滇重樓條形碼的準確性。通過比對發(fā)現(xiàn)，葉綠體上的psbA-trnH 片段在滇重樓種內(nèi)變異很小，即不同產(chǎn)地間個體的序列相似性達到(98.2%～100%)，說明該片段在滇重樓種內(nèi)的信息位點很穩(wěn)定;而種間比較發(fā)現(xiàn)，滇重樓與重樓屬下的其它重樓種間的序列相似性低于96%，即該片段在種間變異幅度較大，可以輕易地將不同種重樓區(qū)分開來。因此僅從序列的相似性程度就可以將滇重樓與其它重樓種區(qū)分開來。

為了找到滇重樓特有的DNA 條形碼，發(fā)明人通過序列比對分析，找出了滇重樓內(nèi)部穩(wěn)定的信息位點，而這些位點恰恰區(qū)別于重樓屬下的其它重樓植物，詳細信息見表2。通過這些特有的信息位點，可以輕易的將滇重樓植物與重樓屬下的其他重樓植物鑒別開來。另外，psbA-trnH 片段序列兩端的序列都很保守，便于通用引物的設(shè)計，十分適合做滇重樓的DNA 條形碼，該條形碼的發(fā)現(xiàn)對于滇重樓道地藥材的保護利用具有十分重要的作用。

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