環(huán)帶小薄孔菌發(fā)酵液的化學(xué)成分研究

合力強(qiáng)，楊曉艷，馮 濤，李正輝，董澤軍，劉吉開*

1中國科學(xué)院昆明植物研究所 植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201;2中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049;3 昆明理工大學(xué)，昆明 650500

環(huán)帶小薄孔菌(Antrodiella zonata)，屬于平革菌科(Phanerochaetaceae)薄孔菌屬(Antrodiella)的一種木棲寄生高等真菌，覆瓦狀疊生，菌蓋具同心環(huán)帶，菌肉革質(zhì)，厚可達(dá)4 mm。在我國主要分布在安徽、重慶、福建、廣東、廣西、貴州、河南、湖北、湖南、四川、云南、浙江等地的闊葉林區(qū)，通常生長在闊葉樹的活立木、死樹和倒木上，作藥用具有抗細(xì)菌和抗腫瘤等功效［1］。該菌曾經(jīng)被命名為鮭貝革蓋菌(Coriolus consors)，后由戴玉成等菌物學(xué)家根據(jù)新近的研究成果和最新命名法規(guī)進(jìn)行訂正，將其修正為環(huán)帶小薄孔菌(Antrodiella zonata)［2］。據(jù)文獻(xiàn)［3］報(bào)道，早在1969 年就從該菌發(fā)酵液中分離得到具有抗菌活性的革蓋菌素(coriolin)，為了進(jìn)一步研究其次生代謝產(chǎn)物，找尋更好的活性化合物，我們對(duì)該菌發(fā)酵液進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，從其乙酸乙酯萃取浸膏中分離得到8 個(gè)化合物，其中化合物1 為新化合物。

1 儀器與材料

比旋光度值由Horbia SEPA-300 旋光儀測(cè)定;IR 由Bruker Tensor27 型紅外光譜儀測(cè)定(KBr 壓片);ESI-MS 由Xevo TQ-S 質(zhì)譜儀和Bruker HCT/Esquire 質(zhì)譜儀測(cè)定;高分辨質(zhì)譜HR ESI-MS 由Agilent G6230 TOF 質(zhì)譜儀測(cè)定;1H NMR 和13C NMR 由Bruker AV-600 和Ascend 600 測(cè)定，內(nèi)標(biāo)為TMS;柱層析硅膠(80～100 目和200～300 目)和薄層層析材料均為青島海洋化工廠生產(chǎn);制備型MPLC 為Büchi 公司產(chǎn)品，由Büchi fraction collector C-660、Büchi pump module C-605 和Büchi manager C-615 組成(Büchi Labortechnik AG，F(xiàn)lawil，Switzerland)，分析型和制備型HPLC 為Agilent 1100 HPLC，色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm ×150 mm，5 μm)和YMC(9.4 mm ×150 mm，5 μm)柱;Sephadex LH-20為Amersham Biosciences 公司產(chǎn)品;RP-18(40～63 μm)為德國Merck 公司產(chǎn)品。顯色方法為254、365 nm 熒光，10%硫酸乙醇溶液和硫酸香草醛處理后加熱及碘蒸氣顯色。

環(huán)帶小薄孔菌(Antrodiella zonata)于2012 年9月采自廣東省始興縣車八嶺保護(hù)區(qū)，由北京林業(yè)大學(xué)戴玉成教授鑒定。

2 培養(yǎng)與發(fā)酵

由昆明植物研究所李正輝工程師采用斜面轉(zhuǎn)搖瓶液體培養(yǎng)的方法對(duì)該菌種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)基:葡萄糖5%，豬肉蛋白胨0.15%，酵母粉0.5%，KH2PO4和MgSO4各0.05%，150 rpm，24 ℃暗培養(yǎng)25 d，發(fā)酵液總量為20 L。

3 提取與分離

環(huán)帶小薄孔菌發(fā)酵液(20 L)濾除菌絲體后濃縮至1 L，用乙酸乙酯萃取三次，合并提取液蒸干得浸膏5.6 g。用制備型MPLC 進(jìn)行粗分，甲醇-水(0%→100%)梯度洗脫得到A～F 組分。組分B(甲醇-水20%)先上凝膠Sephadex LH-20(甲醇)柱，再經(jīng)制備型HPLC，用乙腈-水(5%～20%)梯度洗脫，純化得到化合物6(11.0 mg)、7(8.5 mg)。組分D(甲醇-水60%)經(jīng)正相硅膠柱層析，用甲醇-氯仿溶劑系統(tǒng)(50 ∶1 →10 ∶1)梯度洗脫，后用制備型HPLC (乙腈-水15%～40%)分離，再經(jīng)凝膠Sephadex LH-20(丙酮)純化得化合物1(1.8 mg)、2(6.0 mg)、3(3.5 mg)、8(15.0 mg)。組分E(甲醇-水80%)先上凝膠Sephadex LH-20(甲醇-氯仿1∶1)柱層析，再經(jīng)正相柱色譜(石油醚-丙酮10∶1)等度洗脫，最后再次利用凝膠Sephadex LH-20(甲醇-氯仿1∶1)純化，得化合物4(5.0 mg)、5(7.0 mg)。

4 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 的分子式由其HR-ESI-MS m/z 281.1732［M +Na］+(calcd for C14H26O4Na，281.1729)確定為C14H26O4，不飽和度為2。其紅外在3445 cm-1和1634 cm-1處的吸收峰暗示該化合物含有羥基和羰基。從其13C NMR(DEPT)譜中可以看出含有一個(gè)CO，兩個(gè)連氧CH，一個(gè)連氧CH2，五個(gè)CH2、三個(gè)CH3和兩個(gè)季碳。羰基占了1 個(gè)不飽和度，由于碳譜顯示不含雙鍵，推測(cè)另一不飽和度只能是成環(huán)。分子含4 個(gè)氧，其中之一為羰基，另外3 個(gè)推測(cè)為羥基。

根據(jù)其1H-1H COSY 信號(hào):H-12 (δH3.50，2H，t，J=6.0 Hz)與H-11 (δH1.45，2H，m)相關(guān)，H-11(δH1.45，2H，m)與H-10b (δH1.17，1H，m)相關(guān)可確定C-10、C-11、C-12 相連，且C-12 連有羥基;H-6(δH3.44，1H，ddd，J=11.7，4.8，3.0 Hz)與H-5(δH3.90，1H，m)、H-7a (δH1.67，1H，m)、H-7b (δH1.52，1H，m)相關(guān)且H-5 (δH3.90，1H，m)與H-6(δH3.44，1H，ddd，J=11.7，4.8，3.0 Hz)、H-4a(δH2.56，1H，ddd，J=14.5，3.6，3.6 Hz)、H-4b(δH1.69，1H，m)相關(guān)可確定C-4、C-5、C-6、C-7 相連，且C-5、C-6 各連有一個(gè)羥基。再根據(jù)其HMBC信號(hào):H-1 (δH2.24，3H，s)與C-2 (δC215.8，s)、C-3(δC56.1，s)相關(guān)表明羰基在2 位;H-4b (δH1.69，1H，m)、H-5 (δH3.90，1H，m)與C-3 (δC56.1，s)相關(guān)，表明C-3 與C-4 相連;H-4b (δH1.69，1H，m)與C-9 (δC38.7，s)相關(guān)表明C-9 只能與C-3 相連;H-8a(δH2.21，1H，m)與C-3 (δC56.1，s)、C-7 (δC26.8，t)相關(guān)表明C-3、C-7、C-8 相連;H-10b (δH1.17，1H，m)、H-13 (δH0.88，3H，s)、H-14 (δH0.91，3H，s)與C-9 (δC38.7，s)相關(guān)表明C-9 與C-10、C-13、C-14 相連，由此化合物1 確定為薄孔菌素(因?yàn)橥瑢俚钠渌N還有可能含有類似結(jié)構(gòu)的化合物，所以根據(jù)該種真菌的屬名來命名化合物1，稱其為薄孔菌素;英文則采用antrodiellone，屬名去掉尾字母a 加上酮的后綴one)。再根據(jù)其ROSEY 信號(hào)，如圖1 所示，可判斷該化合物的相對(duì)構(gòu)型為環(huán)上兩個(gè)羥基與甲基酮位于同側(cè)。

表1 化合物1 的1D 和2D NMR 數(shù)據(jù)(600/150 MHz，CD3OD)Table 1 1D and 2D NMR data of 1 at 600/150 MHz，respectively，in CD3OD

圖1 化合物1 的結(jié)構(gòu)和ROESY 相關(guān)Fig.1 Chemical structure and ROESY correlations of 1

化合物1 經(jīng)旋光儀測(cè)得旋光值為-3.52，懷疑該化合物為外消旋體，于是分別采用普通正相柱和手性柱進(jìn)行HPLC 分析，分析測(cè)試條件如下，色譜柱型號(hào):1、普通柱SunFire Prep Silica(4.6 mm ×150 mm，5 μm);2、手性柱CHIRALPAK AD-H(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速:1 mL/min，流動(dòng)相:異丙醇-正己烷(20∶80)等度洗脫，檢測(cè)波長:254 nm。

結(jié)果如圖2 所示，圖2(A)為普通正相柱分析結(jié)果，僅出現(xiàn)一個(gè)峰，相同條件下手性柱分析(圖2B)卻出現(xiàn)兩個(gè)峰，表明該化合物為外消旋體，但由于量少無法拆分，只能通過ROSEY 來確定其相對(duì)構(gòu)型(圖2 峰保留時(shí)間較短是由于普通柱柱長較手性柱短所造成)。

圖2 化合物1 普通正相柱(A)與手性柱(B)分析的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of compound 1 under normal phase column (A)and chiral column (B)

化合物2 C29H46O3;白色粉末;ESI-MS (positive)m/z 465 ［M+Na］+;1H NMR (CDCl3，600 MHz)δ:5.22 (1H，dd，J=15.2，7.2 Hz，H-23)，5.18 (1H，dd，J=15.3，7.7 Hz，H-22)，4.16 (1H，d，J=2.6 Hz，H-7)，3.93 (1H，m，H-3)，3.41(3H，s，OCH3)，3.20 (1H，d，J=3.1 Hz，H-6)，1.21-～2.51 (20H，m，甾體母核)，1.02 (3H，d，J=6.7 Hz，H-21)，0.92 (3H，d，J=6.8 Hz，H-28)，0.87 (3H，s，H-18)，0.86 (3H，s，H-19)，0.84 (3H，d，J=6.7 Hz，H-26)，0.82 (3H，d，J=6.8 Hz，H-27);13C NMR (CDCl3，150 MHz)δ:153.3 (s，C-14)，135.3 (d，C-22)，132.1 (d，C-23)，122.5 (s，C-8)，72.6 (d，C-7)，68.8 (d，C-3)，65.2 (s，C-5)，58.5 (d，C-6)，56.7 (d，C-17)，54.5 (q，OCH3)，42.8 (d，C-24)，40.2 (d，C-9)，39.6 (t，C-4)，39.3(d，C-20)，36.5 (t，C-12)，35.9 (s，C-10)，33.1 (d，C-25)，32.1 (t，C-1)，31.2 (t，C-2)，27.2 (t，C-16)，24.9 (t，C-15)，21.2 (q，C-21)，20.0 (q，C-26)，19.7 (q，C-27)，19.2 (t，C-11)，18.2 (q，C-18)，17.6 (q，C-28)，16.5 (q，C-19)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［4］報(bào)道一致，確定該化合物為22E-7α-methoxy-5α，6α-epoxyergosta-8(14)，22-dien-3β-ol。

化合物3 C29H48O3;無色針晶;ESI-MS (positive)m/z467 ［M+Na］+;1H NMR (CD3OD，600 MHz)δ:5.40 (1H，m，H-7)，5.24 (1H，dd，J=15.2，7.0 Hz，H-23)，5.20 (1H，dd，J=15.2，7.5 Hz，H-22)，3.96 (1H，m，H-3)，3.37 (3H，s，OCH3)，3.15 (1H，d，J=4.8 Hz，H-6)，1.29-2.12(22H，m，甾體母核)，1.05 (3H，d，J=6.7 Hz，H-21)，0.98 (3H，s，H-19)，0.95 (3H，d，J=6.8 Hz，H-28)，0.87 (3H，d，J=6.8 Hz，H-27)，0.85 (3H，d，J=6.8 Hz，H-26)，0.62 (3H，s，H-18);13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ:144.5 (s，C-8)，137.0 (d，C-22)，133.2 (d，C-23)，116.0 (d，C-7)，83.9 (d，C-6)，77.0 (s，C-5)，68.3 (d，C-3)，58.2 (q，OCH3)，57.4 (d，C-17)，56.1 (d，C-14)，44.7 (s，C-13)，44.4 (d，C-9)，43.8 (d，C-24)，41.8 (d，C-20)，40.7 (t，C-12)，40.6 (t，C-4)，38.3 (s，C-10)，34.4(d，C-25)，33.7 (t，C-1)，31.7 (t，C-2)，29.2 (t，C-16)，24.0 (t，C-15)，23.0 (t，C-11)，21.7 (q，C-27)，20.5 (q，C-26)，20.1 (q，C-21)，18.8 (q，C-19)，18.2 (q，C-28)，12.7 (q，C-18)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［5］報(bào)道一致，確定該化合物為3β，5α-dihydroxy-6β-methoxyergosta-7，22-diene。

化合物4 C11H10BrNO2;白色針晶;ESI-MS(negative)m/z 188［M-Br］-;1H NMR (CD3OD，600 MHz)δ:8.06 (1H，d，J=7.3 Hz，H-4)，7.95 (1H，s，H-2)，7.44 (1H，d，J=1.2 Hz，H-7)，7.19 (1H，dd，J=7.3，1.2 Hz，H-5)，4.36 (2H，q，CH2)，1.42(3H，t，CH3);13C NMR (CD3OD，150 MHz)δ:167.6(s，C-8)，138.2 (s，C-7a)，133.2 (d，C-2)，127.3(s，C-3a)，123.7 (s，C-6)，22.5 (d，C-5)，121.9(d，C-4)，113.0 (d，C-7)，108.5 (s，C-3)，60.8 (t，CH2)，14.9 (q，CH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6，7］報(bào)道一致，確定該化合物為6-bromo-1H-indole-3-carboxylic acid ethyl ester。

化合物5 C9H6BrNO2;黃色固體;ESI-MS(negative)m/z 160 ［M-Br］-;1H NMR (CD3OD，600 MHz)δ:8.06 (1H，d，J=7.3 Hz，H-4)，7.95 (1H，S，H-2)，7.44 (1H，d，J=1.2 Hz，H-7)，7.19 (1H，dd，J=7.3，1.2Hz，H-5)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］報(bào)道一致，確定該化合物為6-bromo-1H-indole-3-carboxylic acid。

化合物6 C8H10O2;淡黃色針晶;1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ:7.03 (2H，d，J=8.1 Hz，H-2，6)，6.70 (2H，d，J=8.1 Hz，H-3，5)，3.68 (2H，t，J=7.3 Hz，H-8)，2.71 (2H，t，J=7.3 Hz，H-7)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］報(bào)道一致，確定該化合物為對(duì)羥基苯乙醇。

化合物7 C7H8O3;黃色油狀物;ESI-MS (positive)m/z 141 ［M+H］+;1H NMR (CD3OD，600 MHz)δ:9.53 (1H，s，CHO)，7.40 (1H，d，J=3.5 Hz，H-3)，6.60 (1H，d，J=3.5 Hz，H-4)，3.67(2H，t，H-7)，2.58 (2H，t，H-6);13C NMR (CD3OD，150 MHz)δ:179.5 (d，CHO)，175.0 (s，C-5)，163.2 (s，C-2)，124.9 (d，C-3)，110.9 (d，C-4)，57.6 (t，C-7)，30.1 (t，C-6)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報(bào)道一致，確定該化合物為5-羥乙基糠醛。

化合物8 C11H20N2O2;無色針晶;1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ:3.95 (1H，m，H-3)，3.78(1H，m，H-6)，2.23 (1H，m，H-7)，2.06 (1H，m，H-11)，1.75 (1H，m，H-10a)，1.61 (1H，m，H-10b)，1.05 (3H，d，J=7.1 Hz，H-8)，0.95-0.98 (9H，m，H-9，12，13);13C NMR (CD3OD，150 MHz)δ:171.3(s，C-2)，169.7 (s，C-5)，61.5 (d，C-6)，54.4 (d，C-3)，46.0 (t，C-10)，33.7 (d，C-7)，25.3 (d，C-11)，23.6 (q，C-13)，21.8 (q，C-12)，19.3 (q，C-8)，17.8 (q，C-9)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道一致，確定該化合物為環(huán)-(亮-纈)二肽。

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