山茱萸對(duì)腎間質(zhì)纖維化的保護(hù)作用及機(jī)制研究

陳 燁，朱春玲，嚴(yán) 瑞，劉曉霞，宋文玉

貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病風(fēng)濕科，貴陽(yáng) 550004

慢性腎臟疾病(CKD)常緩慢發(fā)展，往往導(dǎo)致廣泛的腎間質(zhì)纖維化(RIF)，最終發(fā)展為終末期腎衰。腎臟纖維化的病理學(xué)特征主要表現(xiàn)為腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化和腎內(nèi)血管硬化［1，2］。腎小管間質(zhì)病變程度對(duì)10年腎臟存活率具有決定性影響，對(duì)腎臟預(yù)后的影響較腎小球病變更為嚴(yán)重。目前，腎間質(zhì)纖維化尚無(wú)有效的治療方法。因此，尋找有效的能夠干預(yù)腎間質(zhì)纖維化的藥物，從而減輕或逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化，阻止殘余腎功能下降顯得尤為重要和迫切。本研究通過(guò)建立SD 大鼠UUO 模型，觀察山茱萸對(duì)其腎間質(zhì)纖維化的影響及其腎組織中YKL-40、β-catenin 等表達(dá)的影響，旨在探討腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制及山茱萸對(duì)其的治療作用。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

7 周齡雄性清潔級(jí)SD 大鼠36 只，體重200～250 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(渝)2007-0003，使用許可證號(hào):SYXK。

1.2 藥品與試劑

山茱萸(貴州省同濟(jì)堂中藥有限公司，批號(hào):120818)。YKL-40(bs-1093R)、β-catenin、SABC 免疫組化試劑盒、DAB 顯色劑均購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司。細(xì)胞總蛋白提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce 公司提供;兔抗小鼠Wnt4 和β-catenin、YKL-40、β-actine 一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗均由美國(guó)Cell Signaling 公司提供;ECL 化學(xué)發(fā)光液由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 儀器

組織自動(dòng)脫水機(jī)(型號(hào)ZT-12P2)，石蠟包埋機(jī)(型號(hào)YB-6LF)，石蠟切片機(jī)(型號(hào) Leica RM 2235)，電熱恒溫干燥箱(型號(hào)202-O)，生物組織攤烤片機(jī)(型號(hào)YT-7F)，光學(xué)顯微鏡(型號(hào)OLYMPUS BX51)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 試劑的配制

山茱萸研磨成粉狀，與雙蒸水配成混懸液，按300 mg/Kg/d 灌胃，即配即用。

2.2 動(dòng)物模型制作及分組

參照文獻(xiàn)方法［3］進(jìn)行UUO 模型制備，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，測(cè)體重，尿蛋白陰性后，隨機(jī)分為假手術(shù)組(S 組，12 只)，模型組(U 組，12 只)、山茱萸(300 mg/Kg)干預(yù)組(D 組，12 只)，并據(jù)造模及藥物干預(yù)時(shí)間再分為U7天組、U14天組、D7天組、D14天組，同時(shí)假手術(shù)組相應(yīng)有S7天組、S14天組相對(duì)應(yīng)。模型組(U 組)和山茱萸干預(yù)組(D 組)予10%水合氯醛(2 mL/Kg)腹腔注射麻醉后，無(wú)菌手術(shù)打開(kāi)腹腔分離左側(cè)輸尿管近腎盂端，用4 號(hào)線結(jié)扎并剪斷輸尿管，分層縫合關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組(S 組)只分離但不結(jié)扎和剪斷輸尿管。各組大鼠均自由飲水及進(jìn)食。術(shù)后第1 d 開(kāi)始，用藥組(D 組)胃注山茱萸飲片液(300 mg/Kg)，余兩組胃注同等量生理鹽水。

2.3 標(biāo)本制作及組織病理學(xué)觀察

造模后7、14 d 分別處死各組大鼠，取左側(cè)腎臟立即置于10%福爾馬林中固定48 h，后再進(jìn)一步脫水、石蠟包埋、切片(厚度3 μm)等行蘇木精-伊紅(HE)染色觀察腎組織病理改變。Masson 染色觀察腎間質(zhì)纖維化程度。免疫組化染色檢測(cè)YKL-40、βcatenin 的表達(dá)水平。蛋白免疫印記法檢測(cè)大鼠腎組織Wnt4 和β-catenin、YKL-40 蛋白表達(dá)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One Way ANOVA)，組間兩兩比較方差齊者用LSD 法，如方差不齊，采用Tamhane’s T2 法;各項(xiàng)指標(biāo)之間做Pearson 相關(guān)分析。均以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 造模后情況

各組動(dòng)物存活率均為100%，成功制備UUO 模型，分別于術(shù)后7、14 d 取腎，肉眼可觀察到手術(shù)側(cè)腎臟隨著時(shí)間推移逐漸增大，顏色較對(duì)側(cè)變淺，腎盂腫大明顯，腎皮質(zhì)部分逐漸變薄，其內(nèi)充滿尿液，表明成功建立單側(cè)輸尿管梗阻模型。

3.2 SD 大鼠腎臟的組織病理學(xué)改變

肉眼觀察，S 組大鼠左側(cè)腎臟隨著時(shí)間推移未發(fā)生明顯變化，腎臟大小、形態(tài)正常，顏色呈深紅色，表面光滑無(wú)顆粒感，與右側(cè)腎臟無(wú)明顯差異。模型組及干預(yù)組大鼠左側(cè)腎臟體積較同期S 組及右側(cè)腎臟增大，梗阻上段輸尿管擴(kuò)張明顯，顏色變暗淡，皮髓質(zhì)變薄。隨著時(shí)間的推移，模型組與干預(yù)組大鼠梗阻輸尿管擴(kuò)張?jiān)絹?lái)越嚴(yán)重，顏色淡紅，皮髓質(zhì)明顯變薄，內(nèi)含較多尿液。HE 染色顯示，S 組各時(shí)間點(diǎn)腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常，腎間質(zhì)無(wú)纖維化、水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。U7組腎小管管腔擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞可見(jiàn)較多空泡變性，腎間質(zhì)輕度纖維化、水腫，可見(jiàn)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)。U14組腎小管呈囊性擴(kuò)張，部分萎縮壞死，彌漫性上皮細(xì)胞空泡變性，與小管基底膜彌漫性分離，腎間質(zhì)纖維化程度加重，大量單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)蛋白尿管型、紅細(xì)胞管性。D 組各時(shí)間點(diǎn)病變同U 組類似，其程度均較同期U 組減輕，但仍較S 組病變重。與S 組比較，U 組的腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)(TDI)顯著升高(P＜0.05);而經(jīng)山茱萸干預(yù)后，D 組TDI 顯著降低，與U 組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖1，表1。

表1 各組大鼠TDI 和TFI 的比較(±S)Table 1 Comparison of TDI and TFI in each group (±S)

表1 各組大鼠TDI 和TFI 的比較(±S)Table 1 Comparison of TDI and TFI in each group (±S)

注:* P ＜0.05 vs S group;▼P ＜0.05 vs U group;▲P ＜0.05 vs D7th day group.

3.3 Masson 染色

S 組可見(jiàn)腎小管腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，腎間質(zhì)無(wú)纖維陽(yáng)性染色，各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯差異。U7 組腎小管、腎間質(zhì)可見(jiàn)纖維陽(yáng)性染色，腎小管輕度節(jié)段分離;U14 組較U7 組腎間質(zhì)纖維陽(yáng)性染色面積增大，呈束狀、網(wǎng)狀分布，腎小管彌漫性分離，部分腎小管萎縮。D7 組腎間質(zhì)亦可見(jiàn)纖維陽(yáng)性染色，面積較U7 組減少。D14 組腎間質(zhì)可見(jiàn)纖維陽(yáng)性染色面積，呈束狀、網(wǎng)狀分布，腎小管仍有彌漫性分離，腎小管可見(jiàn)萎縮，但程度較U14 組減輕(見(jiàn)圖2)。與S 組比較，U 組的腎間質(zhì)纖維化指數(shù)(TFI)顯著升高(P＜0.05);而經(jīng)山茱萸干預(yù)后，D 組TFI 顯著降低，與U 組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖2，表1。

圖2 各組大鼠腎組織Masson 染色(×200)Fig.2 Masson staining of renal tissue in each group (×200)

3.4 免疫組化法檢測(cè)YKL-40 的表達(dá)

S 組腎間質(zhì)見(jiàn)少量的YKL-40 表達(dá)，7、14 d 時(shí)兩組表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);U7組可見(jiàn)YKL-40 在腎小球、腎間質(zhì)、腎小管上皮細(xì)胞胞漿均有陽(yáng)性表達(dá)，其陽(yáng)性染色部位平均光密度值較S7組升高，U14陽(yáng)性染色部位平均光密度值較S14組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);D 組仍可見(jiàn)腎間質(zhì)、腎小管上皮細(xì)胞漿、腎小球YKL-40 的陽(yáng)性表達(dá)，但較U 組同期各個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)顯著降低(P＜0.05);但D7組YKL-40 的表達(dá)仍高于S7組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，D14組YKL-40 的表達(dá)高于S14組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(見(jiàn)圖3、表2)。

圖3 各組大鼠腎組織免疫組化之YKL-40 的表達(dá)Fig.3 IHC of YKL-40 expression in the renal tissues of rats

表2 免疫組化法測(cè)定各組大鼠腎組織YKL-40 和β-catenin 表達(dá)(±S)Table 2 Expression of YKL-40 and β-catenin in renal tissues of rats with immunohistochemistry(±S)

表2 免疫組化法測(cè)定各組大鼠腎組織YKL-40 和β-catenin 表達(dá)(±S)Table 2 Expression of YKL-40 and β-catenin in renal tissues of rats with immunohistochemistry(±S)

注:* P ＜0.05 vs S group;▼P ＜0.05 vs U group;▲P ＜0.05 vs D7th day group.

3.5 免疫組化法檢測(cè)β-catenin 的表達(dá)

β-catenin 在S 組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)大鼠腎間質(zhì)內(nèi)均可見(jiàn)少量表達(dá)，隨著時(shí)間的推移，β-catenin 的表達(dá)未見(jiàn)明顯增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);U 組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均可見(jiàn)β-catenin 在腎間質(zhì)、腎小管上皮細(xì)胞上陽(yáng)性表達(dá)，其平均光密度值顯著高于S 組同時(shí)間點(diǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);U14平均光密度值高于U7平均光密度值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);D 組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上可見(jiàn)β-catenin 在腎間質(zhì)及腎小管上皮細(xì)胞上陽(yáng)性表達(dá)，但D14平均光密度值顯著低于D7光密度值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且D14光密度值低于U14光密度值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(見(jiàn)圖4，表2)。

圖4 各組大鼠腎組織免疫組化之β-catenin 的表達(dá)Fig.4 IHC of β-catenin expression in the renal tissues of rats

3.6 蛋白免疫印記法檢測(cè)大鼠腎組織Wnt4 和βcatenin、YKL-40 蛋白表達(dá)

與S 組比較，U 組Wnt4 和β-catenin、YKL-40 蛋白表達(dá)量顯著升高(P＜0.05);而經(jīng)山茱萸干預(yù)后，D 組Wnt4 和β-catenin、YKL-40 蛋白表達(dá)量顯著降低，與U 組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖5，表3。

3.7 相關(guān)性分析

經(jīng)相關(guān)性分析，TDI 與Wnt4、β-catenin、YKL-40均呈顯著正相關(guān)(P＜0.001);TFI 與Wnt4、β-catenin、YKL-40 均呈顯著正相關(guān)(P＜0.001);YKL-40與Wnt4、β-catenin 呈顯著正相關(guān)(P＜0.001);βcatenin 與Wnt4 呈顯著正相關(guān)(P＜0.001)。

表3 各組大鼠腎組織蛋白免疫印記之Wnt4 和β-catenin 蛋白、YKL-40 的表達(dá)(±S)Table 3 The expression of Wnt4，β-catenin and YKL-40 protein in renal tissues of rats(±S)

表3 各組大鼠腎組織蛋白免疫印記之Wnt4 和β-catenin 蛋白、YKL-40 的表達(dá)(±S)Table 3 The expression of Wnt4，β-catenin and YKL-40 protein in renal tissues of rats(±S)

注:* P ＜0.05 vs S group;▼P ＜0.05 vs U group。

圖5 各組大鼠腎組織蛋白免疫印跡之Wnt4 和β-catenin、YKL-40 蛋白的表達(dá)Fig.5 Western blotting of Wnt4，β-catenin and YKL-40 in renal tissue of rats

4 討論

幾丁質(zhì)酶樣蛋白YKL-40 是一個(gè)相對(duì)分子量為40000 的肝磷脂和殼質(zhì)鏈接的凝集素?；罨木奘杉?xì)胞、中性粒細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、關(guān)節(jié)炎患者的軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞均可分泌YKL-40。體外實(shí)驗(yàn)中，其誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞成熟，并由后期分化的巨噬細(xì)胞和活化的巨噬細(xì)胞分泌，與先天免疫系統(tǒng)及胞外基質(zhì)重塑有關(guān)［4，5］。健康人血漿中雖然存在YKL-40，但濃度較為固定，不受生理活動(dòng)影響。有研究表明，YKL-40 以一種劑量依賴方式刺激組織細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、滑膜細(xì)胞及軟骨細(xì)胞等人體的連接組織細(xì)胞增生，同時(shí)還可調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞及滑膜細(xì)胞的有絲分裂，在細(xì)胞外基質(zhì)形成和基質(zhì)重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，Wnt/β-catenin 信號(hào)途徑在腎臟胚胎發(fā)育和腎臟腫瘤的發(fā)生中均起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，在wnt7b 基因敲除的小鼠急性腎損傷模型中發(fā)現(xiàn)腎小管損傷嚴(yán)重、上皮細(xì)胞再生延遲，提示W(wǎng)nt7b 可能參與了腎小管上皮細(xì)胞損傷后的修復(fù)功能［6］。而Wnt 信號(hào)通路及其效應(yīng)器β-cat 被證實(shí)在傷口愈合過(guò)程中促進(jìn)纖維增生［7，8］。在UUO大鼠模型中wnt/β-catenin 信號(hào)通路異常激活，并參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展。

現(xiàn)代藥理研究已知，山茱萸的果肉含山茱萸環(huán)烯醚萜總苷、莫羅忍冬苷、熊果酸、沒(méi)食子酸、維生素A 等，具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎抗氧化、降血糖等作用［9］。研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸環(huán)烯醚萜總苷不僅能顯著降低DN 大鼠的尿微量白蛋白，減輕腎臟病理學(xué)改變，并可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激來(lái)保護(hù)腎臟組織。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，山茱萸環(huán)烯醚萜苷對(duì)抗AGEs 對(duì)腎小球系膜細(xì)胞損傷的機(jī)制，可能是通過(guò)抑制氧化應(yīng)激保護(hù)腎小球系膜細(xì)胞免受AGEs 的損害［10］。

本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腎組織腎小管上皮及間質(zhì)細(xì)胞中即有少量YKL-40 表達(dá)，其平均光密度約為0.0193 ±0.0004，隨時(shí)間增加表達(dá)相對(duì)恒定，無(wú)明顯變化。目前有研究發(fā)現(xiàn)健康人血漿中就存在YKL-40，且濃度較為固定，不受生理活動(dòng)影響［11］，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他學(xué)者觀察到的結(jié)果一致，說(shuō)明YKL-40 在正常腎組織中可能起維持特定生理功能的作用。模型組隨時(shí)間的增加，腎小管上皮及間質(zhì)細(xì)胞中YKL-40 陽(yáng)性表達(dá)明顯增強(qiáng)，U7天組與U14天組分別與假手術(shù)對(duì)應(yīng)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表2～3)，U7天組與U14天組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表2～3)。隨著腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，YKL-40 的表達(dá)在顯著增強(qiáng)的同時(shí)，還與Wnt4、β-Cats 呈顯著正相關(guān)關(guān)系，因而提示其可能參與了腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展。提示YKL-40 可能是一個(gè)內(nèi)源性的促纖維化細(xì)胞因子。

目前對(duì)YKL-40 的研究尚不夠深入，其參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路目前尚未明確。Wnt4 及β-catenin 信號(hào)通路是重要的反應(yīng)腎間質(zhì)纖維化過(guò)程的信號(hào)通路。模型組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均可見(jiàn)β-catenin 在腎間質(zhì)、腎小管上皮細(xì)胞上陽(yáng)性表達(dá)，其平均光密度值顯著高于同期假手術(shù)組(P＜0.05);U14天組平均光密度值高于U7天組(P＜0.05)，同時(shí)，與S 組比較，U組Wnt4 和β-catenin、YKL-40 蛋白表達(dá)量顯著升高(P＜0.05);而經(jīng)山茱萸干預(yù)后，D 組Wnt4 和βcatenin、YKL-40 蛋白表達(dá)量顯著降低，與U 組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與免疫組化檢測(cè)結(jié)果相一致，提示W(wǎng)nt4 及β-catenin 信號(hào)通路參與了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，YKL-40 與β-Cats 呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.987，P＜0.001)，提示YKL-40 與該信號(hào)通路存在正向聯(lián)系的可能性極大，但其具體作用環(huán)節(jié)及機(jī)制，以及在此通路中所處的上下游位置，尚待日后進(jìn)一步深入研究。

研究結(jié)果還顯示，藥物治療組與同期模型組比較，YKL-40、β-catenin 表達(dá)均有所下降(P＜0.05)，說(shuō)明山茱萸治療后，腎間質(zhì)纖維化有所減輕，推測(cè)其對(duì)腎臟具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過(guò)減少Wnt4 及β-catenin 信號(hào)通路的激活，下調(diào)YKL-40 的激活和釋放來(lái)發(fā)揮作用。但本研究?jī)H對(duì)YKL-40 在腎間質(zhì)纖維化中的作用做了初步探索，未對(duì)其發(fā)病的具體信號(hào)通路及作用環(huán)節(jié)進(jìn)行深入研究，且缺乏YKL-40 敲除老鼠模型的相關(guān)數(shù)據(jù)作為參照，在下一步的研究中擬通過(guò)YKL-40 敲除老鼠模型研究YKL-40 在腎間質(zhì)纖維化中的作用，以及山茱萸作用的具體通路進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。

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