蜜楝花及果實(shí)中吳茱萸堿、吳茱萸次堿及內(nèi)酯含量積累變化研究

馬英麗，楊秋琛，尹陽(yáng)陽(yáng)，趙 樺

陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，漢中 723000

蜜楝(Evodia lenticellataHuang)為蕓香科吳茱萸屬植物，主要分布于我國(guó)陜西南部和四川等地［1，2］。該植物近成熟果實(shí)在民間可入藥，功效同吳茱萸果實(shí)。

吳茱萸生物堿是吳茱萸屬植物吳茱萸、石虎、疏毛吳茱萸的干燥近成熟果實(shí)中的一類主要生物堿成分［3］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸生物堿類具有重要的藥用價(jià)值，具有抗腫瘤、保護(hù)心臟、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)、調(diào)節(jié)血糖、減肥、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用，對(duì)阿爾茨海默病作用治療也有一定的療效［4-8］，在臨床得到日益廣泛的應(yīng)用。

目前，對(duì)吳茱萸有效成分及其藥理作用的研究主要集中在吳茱萸、石虎、疏毛吳茱萸植物，對(duì)同屬植物蜜楝的研究尚不多見，本實(shí)驗(yàn)室曾對(duì)蜜楝近成熟果實(shí)中脂肪酸和多糖成分做過研究報(bào)道，發(fā)現(xiàn)與吳茱萸果實(shí)相比，蜜楝果實(shí)中脂肪酸和多糖的含量及抗菌、抗氧化作用基本相同［9，10］。本文對(duì)陜西漢中產(chǎn)蜜楝不同生長(zhǎng)階段的花、果實(shí)中吳茱萸、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯成分進(jìn)行了分析研究，并與同地產(chǎn)吳茱萸花和果實(shí)中吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿三種成分積累變化進(jìn)行比較，以期了解蜜楝植物有效成分含量及其積累動(dòng)態(tài)變化，以期為該植物資源的開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備

Waters e2695 高效液相色譜儀，2489 紫外檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，Empower 色譜工作站(美國(guó)Waters 公司);AB204-S 電子分析天平(瑞士Mettler Toledo 公司);KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司);UPH-IV-20T 優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(成都超純科技有限公司);SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 材料與試劑

蜜楝和吳茱萸花及果實(shí)于2014年6月至11月，采自陜西省漢中市漢臺(tái)區(qū)雷家巷，經(jīng)陜西理工學(xué)院楊培君教授鑒定為蕓香科吳茱萸屬植物蜜楝和吳茱萸。實(shí)驗(yàn)材料取自同一生長(zhǎng)地植株，每次在5～10 株基本相同的植株上不同部位隨機(jī)取樣，以保證不同時(shí)間所采實(shí)驗(yàn)材料中有效成分含量變化對(duì)比的科學(xué)性。吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿及吳茱萸次堿標(biāo)品購(gòu)自上海同田生物技術(shù)股份有限公司(批號(hào)分別為:15011423、14021835、14022444)。

乙腈、四氫呋喃、甲醇均為色譜純，其他試劑為分析純，水為自制超純水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

Waters e2695 高效液相色譜儀，Inertsil ODS-3C18色譜柱(4.6 ×150 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈-四氫呋喃-水混合溶液(41∶1∶58)，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 樣品溶液的制備

取蜜楝樣品，在55 ℃條件下烘干，粉碎過65 目篩。稱取約0.5 g，精密稱定，置于具塞100 mL 錐形瓶中，加45 mL 甲醇溶液，準(zhǔn)確稱重。在超聲功率為120 W 超聲頻率為40 KHz，溫度為30 ℃條件下，超聲提取40 min，取出，放冷，稱重，用純甲醇溶液準(zhǔn)確定容至50 mL 容量瓶，進(jìn)樣前用0.45 μm 的濾膜過濾。同一生長(zhǎng)時(shí)期實(shí)驗(yàn)材料制備三個(gè)重復(fù)樣品供試液，每份樣品供試液分別進(jìn)樣測(cè)定3 次。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取吳茱萸內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品9.93 mg，用甲醇定容于10 mL 容量瓶中，制成0.993 mg/mL 母液，稱取吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品11.10 mg，用甲醇定容于25 mL 容量瓶中，制成0.444 mg/mL 母液，稱取吳茱萸次堿標(biāo)準(zhǔn)品10.310 mg，用甲醇定容于25 mL 容量瓶中，制成0.412 mg/mL 母液，得相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液備用。

準(zhǔn)確量取吳茱萸內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0.5、1、1.5、2、2.5 mL，分別用甲醇溶液定容至10 mL 的棕色容量瓶中，配制成濃度分別為49.65、99.30、148.95、198.60、248.25 μg/mL 的吳茱萸內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品梯度溶液備用。

準(zhǔn)確量取吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0.5、1、2、3、4、5 mL，分別用甲醇溶液定容至25 mL 的棕色容量瓶中，配制成濃度分別為8.88、17.76、35.52、53.28、71.04、88.80 μg/mL 的吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品梯度溶液備用。

準(zhǔn)確量取吳茱萸次堿標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL，分別用甲醇溶液定容至25 mL 的棕色容量瓶中，配制成濃度分別為8.25、16.50、24.74、32.99、41.24、49.49 μg/mL 的吳茱萸次堿標(biāo)準(zhǔn)品梯度溶液備用。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性關(guān)系考察結(jié)果

按照2.1 項(xiàng)下方法，分別測(cè)定2.3 項(xiàng)下三種標(biāo)準(zhǔn)品梯度溶液，每個(gè)濃度分別進(jìn)樣三次，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得吳茱萸內(nèi)酯的回歸方程為Y吳茱萸內(nèi)酯=1955.4X-5577.3(R2=0.9996)，在49.65～248.25 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。吳茱萸堿的回歸方程為Y吳茱萸堿=89913X+73191 (R2=0.9990)，在8.88～88.80 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。吳茱萸次堿回歸方程為Y吳茱萸次堿=56127X-51856(R2=0.9990)，在8.25～49.49 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

分別取濃度為204.40 μg/mL 的吳茱萸內(nèi)酯母液3 mL，濃度為88.80 μg/mL 的吳茱萸堿母液3 mL，以及濃度為49.49 μg/mL 的吳茱萸次堿母液3 mL，三種母液均加入10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，可得吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿及吳茱萸次堿的混合標(biāo)品，其中吳茱萸內(nèi)酯的濃度為61.32 μg/mL，吳茱萸堿的濃度為26.64 μg/mL，吳茱萸次堿的濃度為14.85 μg/mL。三種標(biāo)品混合溶液的色譜圖見圖1 A。

3.2 精密度試驗(yàn)

按照2.1 項(xiàng)下方法，分別用吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5 次，每次進(jìn)樣10 μL，吳茱萸內(nèi)酯峰面積的RSD為0.75%，吳茱萸堿峰面積的RSD為0.81%，吳茱萸次堿峰面積的RSD為1.15%，實(shí)驗(yàn)表明儀器精密度良好。

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一蜜楝樣品6 份，每份約0.5 g，均精密稱定。按2.3 項(xiàng)下方法制備供試液，按2.1 項(xiàng)下條件測(cè)定，每份進(jìn)樣3 次，每次進(jìn)樣10 μL。吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿峰面積的RSD分別為3.35%、1.17%和1.86%，說(shuō)明本文實(shí)驗(yàn)方法對(duì)蜜楝三種成分的測(cè)定均有很好的重現(xiàn)性。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按2.3 項(xiàng)下方法用某一份蜜楝樣品制備供試液，供試液分別于提取后0、1、2、4、8、12、24、48 h 按照2.1 項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿峰面積的RSD分別為4.23%、1.42%和3.07%，說(shuō)明蜜楝樣品供試液中吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿及吳茱萸次堿在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

3.5 加樣回收率試驗(yàn)

稱取同一蜜楝樣品6 份，每份0.2 g，精密稱定，向6 份樣品中分別加入3.9 mg 吳茱萸內(nèi)酯對(duì)照品;稱取同一蜜楝樣品6 份，每份0.5 g，精密稱定，向6份供試樣品中分別加入2.1 mg 吳茱萸堿對(duì)照品;稱取同一蜜楝樣品6 份，每份0.5 g，精密稱定，向6 份樣品中分別加入1.32 mg 吳茱萸次堿對(duì)照品，按2.3 項(xiàng)下方法制備供試液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿加樣回收率實(shí)驗(yàn)(n=6)Table 1 Spiked recovery of evodin，evodiamin and rutaecarpine (n=6)

3.6 樣品含量測(cè)定

3.6.1 蜜楝花及果實(shí)中三種成分含量測(cè)定

稱取不同發(fā)育階段的蜜楝花及果實(shí)共7 個(gè)樣品各3 份，每份0.5 g，精密稱定。按照2.3 項(xiàng)下方法制備供試液，按照2.1 項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，每份樣品供試液進(jìn)樣3 次，每次進(jìn)樣10 μL。測(cè)得7 個(gè)發(fā)育時(shí)間段樣品中吳茱萸內(nèi)酯含量在4.63～27.39 mg/g 之間，吳茱萸堿含量在0.09～12.55 mg/g 之間，測(cè)得吳茱萸次堿含量在0.21～3.46 mg/g 之間。樣品含量測(cè)定色譜圖見圖1 B，不同發(fā)育階段吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿及吳茱萸次堿含量和RSD見表2。

表2 蜜楝、吳茱萸不同生長(zhǎng)階段花與果實(shí)中吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 2 Determination results of the content of evodin，evodiamin and rutaecarpine in different growth stages of E.lenticellata and E.rutaecarpa fruits and flowers (n=3)

3.6.2 吳茱萸花及果實(shí)中三種成分含量測(cè)定

稱取吳茱萸花、幼果及果實(shí)三個(gè)發(fā)育階段樣品各3 份，每份0.5 g，精密稱定。按照2.3 項(xiàng)下方法制備供試液，按照2.1 項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，每份樣品供試液進(jìn)樣3 次，每次進(jìn)樣10 μL。測(cè)得吳茱萸花、幼果和近成熟果樣品中吳茱萸內(nèi)酯含量在11.77～14.32 mg/g 之間，吳茱萸堿含量在0.69～17.38 mg/g 之間，測(cè)得吳茱萸次堿含量在0.28～3.21 mg/g 之間。蜜楝、吳茱萸不同發(fā)育階段吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿及吳茱萸次堿含量和RSD見表2。

圖1 混合對(duì)照品(A)及蜜楝果實(shí)樣品(B)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standards (A)and sample of E.lenticellata fruit (B)

4 結(jié)論與討論

HPLC 法測(cè)定不同植物中生物堿及內(nèi)酯含量時(shí)所用流動(dòng)相不盡相同，多為乙腈、四氫呋喃及水混合溶液，三種溶液的比例有一定的變化［11］。本實(shí)驗(yàn)用乙腈-四氫呋喃-水混合溶液作為流動(dòng)相，對(duì)三種溶液的配比情況與吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿及吳茱萸次堿色譜峰的變化進(jìn)行了考察分析，當(dāng)將流動(dòng)相比例調(diào)至41∶1∶58 時(shí)，三種成分的峰形以及與相鄰組分的分離度效果最好，基線平穩(wěn)。故本實(shí)驗(yàn)使用的流動(dòng)相最終確定為乙腈∶四氫呋喃∶水的比例為41∶1∶58。這可能是由于不同材料中所含成分不同而對(duì)生物堿及內(nèi)酯成分的影響不同所致。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著發(fā)育時(shí)間的推移，蜜楝花和果實(shí)中吳茱萸生物堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯的積累逐漸增加，在近成熟果實(shí)中三者的含量均達(dá)到最高，其中吳茱萸內(nèi)酯含量最高(2.74%)，吳茱萸堿次之(1.26%)，吳茱萸次堿較低(0.35%)，蜜楝果實(shí)中三種成分之間含量的差異與吳茱萸果實(shí)中三種成分含量分布的情況相同(表2)。當(dāng)果實(shí)成熟果皮顏色變化時(shí)，三種成分的含量有所下降，這種情況與藥農(nóng)采摘蜜楝果實(shí)的時(shí)間基本相符。研究結(jié)果也表明，與吳茱萸相比，蜜楝花及果實(shí)中這三種成分的積累變化情況與吳茱萸的相似，相比之下蜜楝近成熟果實(shí)中吳茱萸內(nèi)酯的含量較吳茱萸中的豐富，吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量較低于吳茱萸的含量?！吨袊?guó)藥典》(2010 版)規(guī)定，吳茱萸藥材中含吳茱萸堿和吳茱萸次堿的總量不得少于0.15%，含吳茱萸內(nèi)酯(檸檬苦素)不得少于1.0%［12］。本研究結(jié)果表明蜜楝果實(shí)中所含吳茱萸堿和吳茱萸次堿的總量為1.57%，吳茱萸內(nèi)酯含量為2.74%，遠(yuǎn)高于《中國(guó)藥典》中對(duì)吳茱萸藥材的基本要求。因此，蜜楝近成熟果實(shí)可以作為吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯提取制備的一種植物資源，具有良好的開發(fā)利用價(jià)值。

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