甜蕎麥殼原花色素微波輔助提取工藝研究

溫志英，劉 晶，江 柳

河北經(jīng)貿(mào)大學生物科學與工程學院，石家莊 050061

蕎麥屬蓼科雙子葉植物，有甜蕎麥(Fagopyrum esculentumMoench)和苦蕎麥(Fagopyrum tataricumGaertn)兩個主要栽培品種。我國是世界蕎麥主要生產(chǎn)國之一，也是世界蕎麥的起源中心，產(chǎn)量和總種植面積均居世界第二位［1］。在我國，蕎麥籽粒多制粉后食用，而蕎麥殼沒有得到充分利用，一部分制成蕎麥枕頭，剩余的就進行基肥或者焚燒［2］。

國內(nèi)外研究證實蕎麥殼中富含黃烷醇類聚合物——原花色素［3-5］。原花色素(Proanthocyanidins，簡稱PC)，是一類以黃烷-3-醇為主要結(jié)構(gòu)單元的縮合多酚類化合物，由兒茶素、表兒茶素聚合而成，它普遍存在于植物的根、莖、葉、花、果實和樹皮中，已發(fā)現(xiàn)的原花色素含量較高的植物超過600 種［6，7］。植物中的原花色素多數(shù)是不同聚合度的混合物，具有很強的生物活性，能夠清除人體內(nèi)過剩自由基，提高人體免疫能力，并具有較強的抗氧化能力，可作為防癌、抗突變、防治心血管疾病藥物的主要有效成分和用作安全無毒的新型天然抗氧化劑［8］?，F(xiàn)已在臨床醫(yī)學、化妝品、保健食品等領(lǐng)域得到應用［9］。國內(nèi)有關(guān)原花色素的研究中，以葡萄籽、花生紅衣為來源的原花色素研究得最為深入、廣泛［10-13］。但有關(guān)蕎麥殼中原花色素的研究少有文獻涉及。

目前原花色素多采用傳統(tǒng)的有機溶劑提?。?4］，本實驗旨在以甜蕎麥殼為原料，應用微波輔助提取技術(shù)［15］對甜蕎麥殼中原花色素的提取方法進行研究，不僅速度快、成本小，且提高了提取率，同時結(jié)合響應曲面法優(yōu)化了提取工藝條件，這可為合理有效地綜合利用蕎麥殼資源、構(gòu)建農(nóng)業(yè)固體廢棄物資源利用的綠色模式提供有價值的參考。

1 材料與儀器

1.1 試劑與材料

甜蕎麥殼:市售，產(chǎn)地為內(nèi)蒙古。

兒茶素標準品:中國藥品生物制品檢定所(批號877-200001);顆粒活性碳，國藥化學試劑有限公司;無水乙醇、甲醇:天津市紅巖化學試劑廠;香草醛、石油醚:天津市津東天正精細化學試劑廠;濃鹽酸:北京化學試劑公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BS124S 電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;HH-4 型恒溫水浴鍋，金壇市科興儀器廠;RA-8 微波萃取儀，上海博奧微波能設(shè)備有限公司;DFY-300 g 搖擺式高速中藥粉碎機，溫嶺市大德中藥機械有限公司;SHD-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，保定市高新區(qū)陽光科教儀器廠;722E 型分光光度計，上海光譜儀器有限公司;72-1 型電熱恒溫干燥箱，湖北省黃石市醫(yī)療器械廠。

2 實驗方法

2.1 原料處理

甜蕎麥殼在60 ℃下干燥24 h，在粉碎機中進行粉碎，過80 目篩，按1∶20(m/V)的比例加入石油醚并在30 ℃浸泡脫脂5 h，在真空泵中進行抽濾，濾渣在通風櫥里除去殘留的石油醚24 h，得脫脂甜蕎麥殼粉末，干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 原花色素的提取

準確稱取脫脂后的甜蕎麥殼粉末1.0 g，置于150 mL 具塞三角瓶中，加入一定體積一定濃度的乙醇溶液，水浴30 min，微波提取，真空泵抽濾，活性炭脫色30 min，過濾，定容。利用香草醛-鹽酸法測定原花色素含量。

2.3 原花色素得率的測定

采用香草醛-鹽酸法［16，17］:取待測液1 mL，依次加入4%香草醛-甲醇溶液6 mL，濃鹽酸3 mL，混勻后于室溫條件下顯色15 min，波長500 nm 處測定吸光度，用4%香草醛甲醇液做空白對照。整個過程注意避光操作。

兒茶素標準曲線的繪制:精確稱取兒茶素標準樣品配制1.0 mg/mL 標準溶液，分別取0、0.5、1、1.5、2、2.5 mL，定容10 mL，以香草醛-濃鹽酸法測吸光度，繪制兒茶素標準曲線。

式中:C—查標準曲線對應的原花色素的含量(mg/mL);V—待測定樣品液的體積，mL;m—樣品質(zhì)量，g;n—樣品溶液稀釋倍數(shù)。5.98%—甜蕎麥殼水分含量。

2.4 單因素實驗

稱取甜蕎麥殼粉1.0 g，以乙醇溶液為提取液，以甜蕎麥殼原花色素得率作為提取原花色素的標準，分別考察料液比、乙醇體積分數(shù)、水浴溫度，微波功率和微波時間對甜蕎麥殼原花色素得率的影響。

2.5 Plackett-Burman 實驗設(shè)計

在5 個單因素實驗基礎(chǔ)上，利用Minitab 16 軟件的Plackett-Burman 設(shè)計對甜蕎麥殼原花色素微波提取工藝影響因素的顯著性進行考察，選取5 個影響因子，以得率為響應值進行二級水平試驗。Plackett-Burman 實驗因素水平表見表1。

表1 Plackett-Burman 實驗因素水平及編碼Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

2.6 響應面法設(shè)計

根據(jù)響應面分析軟件提供的模型，以原花色素得率為響應值，在單因素實驗和Plackett-Burman 實驗基礎(chǔ)上，設(shè)計乙醇體積分數(shù)、微波時間、微波功率為因素，進行3 因素3 水平的響應面實驗分析，優(yōu)化甜蕎麥殼原花色素的微波輔助提取條件。數(shù)據(jù)運用Design-Expert 7.0 統(tǒng)計軟件處理。

3 結(jié)果分析

3.1 兒茶素標準曲線

配制1.0 mg/mL 兒茶素標準溶液，以吸光度為橫坐標，兒茶素質(zhì)量濃度為縱坐標，以香草醛—鹽酸法繪制兒茶素標準曲線，并求出其線性回歸方程為y=0.263x-0.007，R2=0.999。

3.2 單因素實驗

3.2.1 乙醇體積分數(shù)對甜蕎麥殼原花色素得率的影響

由圖1A 可知，隨著乙醇濃度增大，原花色素得率呈上升趨勢，這是由于以乙醇-水溶液作為提取劑，能加速原花色素與多糖、蛋白質(zhì)分子之間氫鍵的斷裂，使原花色素分子順利游離至細胞外，從而增大原花色素得率。乙醇體積分數(shù)為30%時原花色素得率最大，之后乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增大，原花色素得率呈下降趨勢，原因主要是由于親脂性強的成分溶出量增加，導致原花色素與乙醇-水分子的結(jié)合率降低，原花色素得率隨之降低。

3.2.2 料液比對甜蕎麥殼原花色素得率的影響

從傳質(zhì)速率的角度講，料液比的提高必然會在較大程度上提高傳質(zhì)推動力，但也提高了生產(chǎn)成本及后續(xù)處理難度，故料液比不宜太高。由圖1B 可知，在料液比為1∶30 g/mL 之前，得率隨料液比的增大而增大，在1∶30 g/mL 時達到最大，但在1∶30 g/mL 之后，得率稍有下降。因此，可選擇料液比1∶30 g/mL。

圖1 乙醇體積分數(shù)(A)、料液比(B)、微波功率(C)、微波時間(D)、水浴溫度(E)對蕎麥殼原花色素得率的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration (A)，solid to liquid ratio (B)，microwave power (C)，microwave time (D)and bath temperature (E)on the yield of proanthocyanidins

3.2.3 微波功率對甜蕎麥殼原花色素得率的影響

微波功率主要是影響升溫速度，功率越大溫度升高越快。從圖1C 可以看出，微波火力在160 W時，得率最大，自此之后逐漸減小。由此可見，當微波時間一定時，微波火力的增加可能會導致部分活性成分損失，原花色素得率下降。

3.2.4 微波時間對甜蕎麥殼原花色素得率的影響

由圖1D 可以看出，隨著微波萃取時間延長，原花色素的得率在30 s 時得率達到最高，時間再延長，得率下降，故適宜的萃取時間是30 s。微波時間與原花色素得率高低密切相關(guān)。由于原花色素是熱不穩(wěn)定物質(zhì)，微波時間過長會導致原花色素分解而使得率下降。

3.2.5 水浴溫度對甜蕎麥殼原花色素得率的影響

由圖1E 可知，在水浴溫度70 ℃以前，隨著水浴溫度升高，原花色素得率不斷增高，表明升高溫度有利于原花色素的溶出。當溫度達到70 ℃時原花色素的得率達到最高，溫度再繼續(xù)升高，得率下降，表明溫度過高會破壞原花色素，不利于提取。故綜合考慮，適宜的水浴溫度是70 ℃。

3.3 Plackett-Burman 實驗結(jié)果及分析

利用Minicab 16 軟件的Plackett-Burman 實驗設(shè)計對微波提取甜蕎麥殼原花色素單因素實驗結(jié)果進行分析，針對水浴溫度、微波功率、微波時間、料液比、乙醇體積分數(shù)5 個因素共進行12 次實驗，各重復三次，取其平均值。Plackett-Burman 實驗設(shè)計及響應值見表2，方差分析見表3。

從表3 可以看出，各因素對響應值(甜蕎麥殼原花色素得率)影響顯著性的順序為:微波時間＞乙醇濃度＞微波功率＞料液比＞水浴溫度。而其中微波時間、乙醇體積分數(shù)和微波功率對甜蕎麥殼原花色素提取液的吸光值具有顯著的影響(P＜0.05)，料液比與水浴溫度對響應值的影響并不顯著?；貧w方程為:

表2 Plackett-Burman 實驗設(shè)計及響應值Table 2 Plackett-Burman experimental design and results

表3 Plackett-Burman 實驗方差分析表Table 3 Variance analysis of Plackett-Burman design

根據(jù)單因素和Plackett-Burman 實驗結(jié)果，確定料液比為1∶30 g/mL，水浴溫度70 ℃，在下面的響應面實驗中重點考察微波功率、微波時間、乙醇體積分數(shù)對原花色素得率的影響。

3.4 響應面優(yōu)化提取工藝

根據(jù)Plackett-Burman 實驗設(shè)計，確定料液比為1∶30 g/mL，水浴溫度70 ℃，改變乙醇體積分數(shù)、微波功率和微波時間三個因素，每個因素選取最佳參數(shù)及左右共三個水平進行響應面分析。采用軟件Design-Expert 7.0 中的Box-Benhnken 實驗設(shè)計原理，以得率為響應值，設(shè)計三因素三水平實驗，見表4。

采用軟件Design-Expert 7.0 中 的 Box-Benhnken 實驗設(shè)計原理，以得率為響應值，響應面分析方案與結(jié)果見表5。

3.4.1 模型的建立及顯著性檢驗

響應面二次回歸方程方差分析見表6，由表6可以看出，A、B、C、A2、B2、C2項達到極顯著水平，A-B交互項影響達到極顯著水平。各因素對提取甜蕎麥殼原花色素得率影響大小關(guān)系為:微波時間(B)＞乙醇體積分數(shù)(A)＞微波功率(C)。

表4 Box-Benhnken 實驗設(shè)計因素與水平Table 4 Factors and levels of Box-Benhnken analysis

表5 微波輔助提取原花色素實驗方案與結(jié)果Table 5 Design and results of response surface experiments

表6 響應面二次回歸方程方差分析Table 6 Regression model of variance analysis results

利用Design-Expert 軟件對表5 數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到得率(Y)對乙醇體積分數(shù)(A)、微波時間(B)和微波功率(C)的二次多項回歸模型:

該方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，Adj R2=0.9997，模型擬合程度良好。由表6 可知，整體模型達極顯著水平(P＜0.01)，表明該二次方程模型極顯著，不同處理間的差異高度顯著。失擬項不顯著(P=0.1639)，表明模型選擇合適。因此可以利用此模型對不同條件下的甜蕎麥殼原花色素得率進行預測。

3.4.2 提取工藝的響應面分析與優(yōu)化

圖2 乙醇濃度和微波時間(A)、微波功率和微波時間(B)、乙醇濃度和微波功率(C)對原花色素得率影響的響應面圖Fig.2 Response surface plots showing the mutual effects of ethanol concentration and microwave time (A)，microwave power and microwave time (B)，microwave power and ethanol concentration (C)on the yield of proanthocyanidins

用Design-Expert 軟件，根據(jù)回歸方程分析作響應面圖2?？梢钥闯?，原花色素得率最初會隨三個因素的逐漸增大而升高，超過實驗所取的各因素中心值時，原花色素得率會隨因素的增大而下降。由圖2A、圖2B 可知，微波時間表現(xiàn)出的響應曲線明顯比乙醇體積分數(shù)和微波功率的響應曲線陡峭，說明微波時間對原花色素得率影響最顯著，由圖2C 可知，乙醇濃度和微波功率交互作用不夠顯著。這與二次回歸方程方差分析結(jié)果一致。

3.4.3 最佳工藝條件的確定及驗證實驗

根據(jù)二次回歸的數(shù)學模型分析結(jié)果，最優(yōu)條件為微波時間27.27 s，乙醇體積分數(shù)33.27%，微波功率274.35 W。為了驗證響應面法的可行性，將單因素實驗所得最佳條件和響應面二次回歸所得最佳條件進行實驗，每個實驗進行三次平行實驗，結(jié)果見表7。結(jié)果表明，響應面所得工藝為最佳工藝，實際得率為2.27%，說明此模型可靠?？紤]到具體實驗的可行性，將提取條件確定為乙醇體積分數(shù)35%，微波時間28 s，微波功率280 W，實際得率為2.21%。

4 結(jié)論

4.1 利用Plackett-Burman 設(shè)計對甜蕎麥殼原花色素微波提取工藝影響因素的顯著性進行考察，其中微波時間、乙醇體積分數(shù)和微波功率對甜蕎麥殼原花色素提取液的吸光值具有顯著的影響(P＜0.05)。

4.2 甜蕎麥殼原花色素優(yōu)化的數(shù)學回歸模型為:Y=2.18 +0.21A-0.22B+0.097C+0.012AB-5 ×10-3AC-0.010BC-0.31A2-0.41B2-0.11C2，此模型在實驗范圍內(nèi)能較準確地預測原花色素的得率。

4.3 結(jié)合實際可行性，甜蕎麥殼原花色素微波提取最佳提取條件為:料液比為1∶30 g/mL，乙醇體積分數(shù)35%，水浴溫度70 ℃，微波提取時間28 s，微波功率280 W，在此條件下甜蕎麥殼原花色素得率為2.21%。

表7 驗證實驗結(jié)果Table 7 Verification results of proanthocyanidins extraction

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