林麝AR基因外顯子1、4、8的克隆和多態(tài)性檢測

王永奇，白 康，任戰(zhàn)軍＊，劉文華，李斐然，黎 勇，朱承嗣，唐 婕，唐青山，王方榮

（1.陜西省動物研究所，陜西 西 安7100321；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動 物科技學(xué)院，陜西 楊 凌712100；3.陜西鎮(zhèn)坪逢春林麝養(yǎng)殖有限公司，陜西 鎮(zhèn) 坪725600）

我國是麝資源分布最廣泛的國家之一，其中，四川與陜西的林麝資源較為豐富。中國境內(nèi)能分泌麝香的麝現(xiàn)有6種，林麝、馬麝、原麝、黑麝、喜馬拉雅麝、安徽麝。林麝（Moschus berezovskii）是分布范圍最廣的品種，體型最小，有4個亞種，分別為指名亞種、越北亞種、云貴亞種、滇北亞種。其中分布于秦嶺的林麝屬于指名亞種。雄性林麝的鼠蹊部有麝香腺，能分泌麝香。麝香是配制高級香水、高級香料的重要原料，具有極高的經(jīng)濟(jì)價值、藥用價值和學(xué)術(shù)研究價值。近代科學(xué)研究及臨床醫(yī)學(xué)證明麝香對于治療東亞國家尤其是中國的很多疾病具有一定的藥理作用，其藥用功效在中國幾千年的中醫(yī)學(xué)中被廣泛應(yīng)用。由于人類對森林過度砍伐，林麝棲息地急劇縮小，這無疑對林麝的生存造成巨大威脅，加之人們對麝香的需求不斷加大，林麝瀕臨滅絕或在一些地方已經(jīng)滅絕。據(jù)估計，20世紀(jì)60年代末，全國總量超過1百萬只。1978-1980年，林麝資源量卻不足60萬只。1980年以后，由于麝香價格不斷攀升，而且人類過度捕獲，導(dǎo)致其數(shù)量急劇下降，至20世紀(jì)90年代末估計已減少至20～30萬只，據(jù)估計90年代初全國只有10～20萬只。由于天然麝香供應(yīng)量不足，以致我國的中醫(yī)藥和化妝品行業(yè)遭受到巨大的打擊。因此我國已于2002年將麝從國家二級重點保護(hù)動物上調(diào)為國家一級重點保護(hù)動物。人工養(yǎng)殖是珍稀動物保護(hù)重要方式之一，我國20世紀(jì)50年代開始人工養(yǎng)麝研究。現(xiàn)已在人工飼養(yǎng)、繁育、取香和疾病防治等方面取得了顯著成績。但是，人工養(yǎng)殖要取得更大成功，必須在基礎(chǔ)研究方面有所加強［1-2］。

香囊為公麝獨有的器官，其腹側(cè)面有前后兩個開口，前面的開口稱之為香囊口，可排出香囊內(nèi)腺體的分泌物［3］。香囊位于腹下部陰囊與臍部之間，呈橢圓形的囊狀物，其分泌物的氣味能夠吸引異性。泌香是雄性林麝的第二性征，與其生殖器官以及雄激素的分泌有著密切的關(guān)系［4］。試驗證明在切除睪丸以及副睪后，林麝將不再產(chǎn)生生殖反應(yīng)的，也就不再有泌香反應(yīng)，不能形成成熟的麝香。當(dāng)給其注射適量的外源性雄激素（丙酸睪丸酮，腦垂體促黃體素和下丘腦促黃體素釋放素等）后，林麝又會出現(xiàn)泌香反應(yīng)并能生成成熟的麝香，而且利用外源性雄激素誘導(dǎo)生香的技術(shù)并不影響雄麝泌香量［5-9］。激素調(diào)節(jié)林麝泌香的途徑如下：丘腦下部→LRH→垂體前葉→LH、FSH→睪丸間質(zhì)細(xì)胞→雄性激素→麝香腺→分泌香液→麝香內(nèi)轉(zhuǎn)化→麝香［10］。綜上所述，雄性激素能誘導(dǎo)林麝泌香。雄性激素受體外顯子序列的變化可能會影響其與配體結(jié)合，從而可能影響到麝香的質(zhì)量。

雄激素受體基因是類固醇激素受體家族成員之一。研究發(fā)現(xiàn)，人類的雄激素受體基因是在X染色體上（Xq11.2-12），是由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成［11］，一般由4個結(jié)構(gòu)域組成：（1）NH2端-轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)AF-1（Exon1），可與激活物或阻遏物結(jié)合從而對AR進(jìn)行調(diào)控；（2）DNA結(jié)合區(qū) DBD（Exon2、Exon3），受體的DBD區(qū)可識別并結(jié)合靶基因上激素反應(yīng)元件，從而誘發(fā)靶基因的有效轉(zhuǎn)錄；（3）鉸鏈區(qū)（HR）；（4）配體結(jié)合區(qū)（LBD）、AF-2，主要決定受體結(jié)合配體的特異性。受體N末端氨基酸組成和長度差異較大，然而DNA結(jié)合區(qū)和配體結(jié)合區(qū)的序列相對保守。AR基因編碼的雄性激素受體（androgen receptor，AR）一種配體依賴型的反式轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，屬于核受體超家族成員，與特異的DNA的序列結(jié)合，通過介導(dǎo)雄激素的作用可調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［11-15］。而配體結(jié)合區(qū)是雄激素特異結(jié)合的區(qū)域，可以介導(dǎo)雄性激素在靶細(xì)胞中發(fā)揮作用，大量研究結(jié)果表明，只有雄激素和雄激素受體結(jié)合才能發(fā)揮重要的、廣泛的生理功能。大量試驗證實：AR基因外顯子多態(tài)性可能在AR活性強弱的平衡中發(fā)揮“微調(diào)”作用，與人類多種疾病的發(fā)生有關(guān)聯(lián)，如男性不育、前列腺癌、子宮肌瘤、乳腺癌等［16-17］；與動物生產(chǎn)性能存在相關(guān)性，例如豬雄性激素受體多態(tài)性對產(chǎn)仔數(shù)有影響［18］。除此之外，麝的泌香與雄性生殖器官及其雄激素分泌的相關(guān)研究鮮有報道。

本研究擬采用PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)，研究雄性激素受體基因外顯子1、4、8的遺傳變異情況，并分析其與泌香量的相關(guān)性，探尋其與林麝泌香性能密切相關(guān)的遺傳標(biāo)記位點，為選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)麝香的林麝提供理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

50頭雄性林麝毛發(fā)樣品（帶毛根）均采自陜西鳳縣的3個養(yǎng)麝場。毛發(fā)來源與文獻(xiàn)［13］相同。置于滅菌包裝袋中，每個個體記錄不同的編號，冷凍保存于-80℃超低溫冰箱中。

主要試劑包括2×ES Taq Master Mix（含染料，康為世紀(jì)生物科技有限公司）、瓊脂糖、快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（康為世紀(jì)生物公司出品）、PGE-T試劑盒、10×TBE 、TEM ED、甲叉、丙烯酰胺、APS、二甲苯青FF、溴酚藍(lán)、Na2EDTA·2 H2O、共離子甲酰胺等。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA的提取 參照文獻(xiàn)［19-20］的方法。

1.2.2 引物設(shè)計 本試驗引物設(shè)計參照文獻(xiàn)［20］所用的擴增引物，均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列及相關(guān)信息Table 1 Primer sequences and related information of AR

表2 PCR擴增體系及其擴增程序Table 2 The PCR amplification systeem and it＇s procedures

1.2.3 PCR擴增 PCR擴增體系和程序按照表2進(jìn)行，每個樣本取4μL PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴增效果。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳 配置30%的丙烯酰胺溶液制膠，待膠完全凝固后，選取瓊脂糖凝膠電泳檢測帶型單一的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分型。具體操作如下：每個樣本取5μL的PCR擴增產(chǎn)物，與5 μL變性劑（95%甲酰胺、10 mmol／L EDTA、0.05%溴酚藍(lán)、0.05%二甲苯青）混合，瞬時離心后，PCR儀中98℃變性10 min，放置冰中驟冷以防DNA雙鏈復(fù)性，放置20 min后，點樣。首先250 V預(yù)電泳15 min，而后110 V電泳過夜。電泳結(jié)束后，將凝膠取出置于超純水中，漂洗兩次后，于1%硝酸銀溶液中染色20 min，要求避光輕搖，染色時間可自行調(diào)整。然后用2%氫氧化鈉和0.1%甲醛配置顯色液，要求現(xiàn)用現(xiàn)配，凝膠在顯色液中顯色，直至呈現(xiàn)出清晰的電泳條帶，要避免顯色時間過長，最后拍照和分析條帶。

圖1 林麝基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳M.DL2000 Marker；1～20.從毛發(fā)中提取基因組DNA結(jié)果Fig.1 1%Agarose gel electrophoresis of forest musk deer genomic DNA M.DL2000 Marker；1～20.genomic DNA of hair tissue with PCR method

1.2.5 測序 首先利用凝膠回收試劑盒對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，將提純的DNA片段與pGEM-T Easy載體相連接（16℃放置8 h）。42℃水浴鍋中熱擊90 s使重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，37℃搖菌使菌體復(fù)蘇，涂板，37℃培養(yǎng)過夜培養(yǎng)后挑取單菌落擴大培養(yǎng)，最后提取菌液中的質(zhì)粒送往華大基因測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的濃度與純度檢測

用Nanodrop檢測DNA濃度和質(zhì)量。結(jié)果顯示樣本260／280值在1.8～2.0之間，說明提取的DNA質(zhì)量均良好，可用于后續(xù)試驗。提取的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，成像后，結(jié)果如圖1所示。由圖可見條帶單一、無拖尾現(xiàn)象，表明從血液中提取的DNA的完整度良好。

2.2 林麝AR基因外顯子（1、4、8）瓊脂糖凝膠電泳檢測

由圖2、3、4可知，條帶單一，無非特異擴增，表明各樣本均獲得了理想的PCR產(chǎn)物，可以用于聚丙烯酰胺凝膠電泳。

圖2 林麝雄性激素受體基因外顯子1 PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR products of AR Exon 1 of forest musk deer

圖3 林麝雄性激素受體基因外顯子4 PCR擴增結(jié)果Fig.3 PCR products of AR Exon 4 of forest musk deer

圖4 林麝雄性激素受體基因外顯子8 PCR擴增結(jié)果Fig.4 PCR products of AR Exon 8 of forest musk deer

2.3 SSCP分析結(jié)果

聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果如下圖，結(jié)果顯示雄麝AR基因三個外顯子都僅有一種帶型，表明三個外顯子均無多態(tài)性。

2.4 測 序

圖5 林麝雄性激素受體基因外顯子1擴增片段SSCP分析Fig.5 SSCP analysis of PCR amplification products of AR Exon1 of forest musk deer

圖7 林麝雄性激素受體基因外顯子8擴增片段SSCP分析Fig.7 SSCP analysis of PCR amplification products of AR Exon8 of forest musk deer

對所有樣本的擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序得到外顯子1、4、8的序列，進(jìn)行多序列比對，結(jié)果顯示，AR基因三個外顯子均為單態(tài)。

3 討 論

比較人、牛、羊、大鼠、雞等AR基因，發(fā)現(xiàn)AR基因的外顯子序列通常具有共同的結(jié)構(gòu)功能，具有同源性，有較高的保守性，突變概率為1／1000。試驗結(jié)果似乎說明了AR基因外顯子1、4、8在秦嶺雄性林麝群中具有一定的保守性。

林麝秦嶺種群從外形特征、毛色等性狀上一致性較高，變異很小，性狀變異視乎很小。但是，種群在繁殖性能、泌香性能上是有明顯變異，故在AR基因外顯子上沒有找到多態(tài)性，歸因于秦嶺林麝種群在AR基因突變可能性較小的，似乎可以說得過去。但是仔細(xì)研究過于牽強，也許還有其他原因，比如采樣問題、引物設(shè)計問題等等。

由于林麝野性強，應(yīng)激性大，樣本采集困難。雖然采集了來自于3個場50個樣本，場際距離又很近，但是樣本量不足夠大，代表性不強，也可能是造成AR基因不具備多態(tài)性的重要原因之一。

目前尚未報道麝科動物或者更近源的物種如鹿科的相關(guān)基因序列或者引物，引物設(shè)計主要參考牛、人、大鼠而得，這可能是造成AR基因不具備多態(tài)性的另一重要原因。還需要進(jìn)一步探索新引物、新基因位點作為研究對象。

圖6 林麝雄性激素受體基因外顯子4擴增片段SSCP分析Fig.6 SSCP analysis of PCR amplification products of AR Exon4 of forest musk deer

因此，在后續(xù)探究林麝有關(guān)高泌香量的候選基因研究中，一方面仍需對林麝雄激素受體基因的序列全長進(jìn)行深入分析，另一方面也可以另辟蹊徑尋找其他相關(guān)候選基因。

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