體液調(diào)控神經(jīng)元在調(diào)控秀麗線蟲固有免疫中的研究進(jìn)展

馬安然

（東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，南京210009）

體液調(diào)控神經(jīng)元在調(diào)控秀麗線蟲固有免疫中的研究進(jìn)展

馬安然

（東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，南京210009）

秀麗隱桿線蟲在受到病原菌感染時(shí)，會(huì)迅速激活固有免疫。神經(jīng)免疫間的交流可以通過神經(jīng)系統(tǒng)釋放神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽及激素來調(diào)控固有免疫反應(yīng)，包括已知的多巴胺信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路和胰島素信號(hào)通路。近年來的研究表明，NPR-1神經(jīng)環(huán)路也參與固有免疫的調(diào)控，并且三個(gè)體液調(diào)控神經(jīng)元AQR、PQR和URX是通過NPR-1神經(jīng)環(huán)路調(diào)節(jié)固有免疫的。線蟲的神經(jīng)系統(tǒng)只有302個(gè)神經(jīng)元，結(jié)構(gòu)也相對(duì)簡(jiǎn)單，線蟲的npr-1基因可編碼與哺乳動(dòng)物神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)具有受體相似的GPCR，這些優(yōu)勢(shì)為研究高等生物神經(jīng)免疫間交流的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。本文就體液調(diào)控神經(jīng)元在調(diào)控秀麗線蟲固有免疫方面展開討論，希望可以為高等生物神經(jīng)免疫間的調(diào)節(jié)機(jī)制提供重要的思路和方法。

秀麗隱桿線蟲；神經(jīng)免疫交流；NPR-1神經(jīng)環(huán)路；體液調(diào)控神經(jīng)元

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）是一類生活在溫度恒定的土壤中，以細(xì)菌為食的線蟲類生物［1］。其個(gè)體小，長(zhǎng)度約1mm，通體透明，可用Ca2+成像技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元的活化［2］。1963年，Brenner［3］提出了將線蟲作為模式生物用于動(dòng)物神經(jīng)發(fā)育的研究，線蟲是第一個(gè)完成基因組全序列測(cè)定的多細(xì)胞生物，可提供構(gòu)建整個(gè)動(dòng)物所用的全部遺傳信息。截至2012年，線蟲體內(nèi)所有神經(jīng)元之間的實(shí)觸連接和神經(jīng)通路網(wǎng)絡(luò)模式都已繪制完成［4-5］，這更加有利于研究神經(jīng)環(huán)路對(duì)行為和有機(jī)體生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)，當(dāng)然也包括固有免疫。此外，線蟲的神經(jīng)系統(tǒng)相對(duì)簡(jiǎn)單、基因操作方便、生長(zhǎng)周期短（在實(shí)驗(yàn)室20°C的情況下，繁殖一代平均要3.5d［1］），是用于研究動(dòng)物感覺和行為的常用模式動(dòng)物。線蟲能感受外界環(huán)境的變化，在應(yīng)對(duì)病原菌感染時(shí)，可誘導(dǎo)固有免疫包括分泌抗菌肽、溶菌酶、凝集素等。

1 體液調(diào)控神經(jīng)元在固有免疫中的功能

1.1 體液調(diào)控神經(jīng)元

圖1 體液調(diào)控神經(jīng)元（gcy-32::gfp）AQR、URX位于頭部，PQR位于尾部Fig.1 Body fluid neurons（gcy-32::gfp）,AQR、URX located at head, PQR at tail

體液調(diào)控神經(jīng)元包括AQR、PQR和URX。線蟲呈蠕蟲狀、兩側(cè)對(duì)稱、無分節(jié)，有四條主要的表皮索狀組織及一個(gè)充滿體液的假體腔［6］，而AQR、PQR、URX是除了CEP之外直接暴露于體腔液中的神經(jīng)元，因此被稱為體液調(diào)控神經(jīng)元［7］。AQR和PQR的感覺纖毛末端直接暴露于體腔液中，而URX沒有纖毛結(jié)構(gòu)的末端于是伸入頭部最前端［8］，如圖1所示。

1.2 體液調(diào)控神經(jīng)元主要感受高氧環(huán)境

線蟲的神經(jīng)系統(tǒng)共有302個(gè)神經(jīng)元［3］，每個(gè)神經(jīng)元都有其特點(diǎn)，基于電鏡三位重建的結(jié)果顯示，按照神經(jīng)元的形態(tài)、神經(jīng)連接及位置將線蟲302個(gè)神經(jīng)元分為118類，每一類中神經(jīng)元的數(shù)目為1～13［9-11］。

線蟲神經(jīng)元按其功能可分為三類，分別為感覺神經(jīng)元、中間神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。感覺神經(jīng)元的感器可以分為兩類，一類具有向外開口的通道，這類通道使部分神經(jīng)結(jié)構(gòu)直接暴露在外界化學(xué)環(huán)境中，另一類則沒有通道結(jié)構(gòu)。前者主要是化學(xué)感受器，后者主要是機(jī)械感受器及其他一些未知功能的感受器［12］。

本文主要敘述感受氧濃度的化學(xué)感受器。土壤中存在不間斷的大腸桿菌代謝活動(dòng)，導(dǎo)致土壤局部氣體濃度變動(dòng)，線蟲要在土壤中生存就必須要感受環(huán)境中的氣體濃度，如O2和CO2的變化。實(shí)驗(yàn)證明線蟲對(duì)中氧氣濃度(5%～12%)有極強(qiáng)的偏好性，而對(duì)過高或過低的氧濃度都表現(xiàn)出躲避效應(yīng)［13］。作為需氧生物，線蟲需要氧氣來維持生存，同時(shí)也要躲避高氧對(duì)DNA和其他大分子的氧化損傷。最主要感受正常水平氧濃度的神經(jīng)元是AQR、PQR、URX和BAG。

AQR、PQR和URX主要感受高氧環(huán)境，BAG則主要感受周圍的低氧環(huán)境。遺傳學(xué)和鈣成像的實(shí)驗(yàn)表明，線蟲對(duì)高氧的感受需要可溶性鳥苷酸環(huán)化酶GCY-35的參與，對(duì)低氧的感受需要GCY-31和GCY-33的參與［14］。升高氧氣濃度在BAG中激發(fā)一個(gè)鈣上升，而降低氧氣濃度則在AQR中激發(fā)一個(gè)鈣上升［15-16］。氧氣調(diào)節(jié)線蟲的聚集行為，并形成社會(huì)性進(jìn)食行為，聚集在一起的社會(huì)性進(jìn)食行為可被氧氣濃度降低所抑制，URX、AQR和PQR在形成社會(huì)性進(jìn)食中起到關(guān)鍵作用，并很可能是氧氣調(diào)節(jié)社會(huì)性進(jìn)食的關(guān)鍵神經(jīng)元［17-18］。

2 NPR-1在調(diào)控線蟲固有免疫中的作用

2.1 NPR-1神經(jīng)環(huán)路

自然條件下，NPR-1僅有2個(gè)等位基因在215位點(diǎn)上的氨基酸有所不同，分別是NPR-1(215V)和NPR-1(215F)。N2線蟲基因是NPR-1(215V)，而npr-1突變體（ad609）的是NPR-1(215F)，NPR-1 (215V)的活性比NPR-1(215F)強(qiáng)得多［19］。

因?yàn)轶w液調(diào)控神經(jīng)元的活性要GCY-35、TAX-2和TAX-4的參與，因此NPR-1可以通過抑制GCY-35、TAX-2和TAX-4的活性來抑制AQR、PQR和URX。當(dāng)線蟲為NPR-1(215F)時(shí)，對(duì)AQR、PQR和URX的抑制作用降低，也就促進(jìn)了線蟲對(duì)高氧的躲避。而高氧是npr-1突變體形成聚集行為最重要的因素，為了躲避高氧損傷，npr-1突變體聚集在PA14菌落的邊緣，因?yàn)槟抢锸羌?xì)菌濃度最高、氧濃度最低的地方，也因此增加了對(duì)PA14的易感性，從而抑制了固有免疫［19］，如圖2所示。

圖2 調(diào)控秀麗線蟲固有免疫的NPR-1神經(jīng)環(huán)路模式圖Fig.2 NPR-1 nerves circuit model of regulating of innate immunity in Caenorhabditis Elegans

2.2 NPR-1對(duì)線蟲固有免疫的調(diào)控

當(dāng)有食物時(shí)，線蟲可以分散進(jìn)食也可以社會(huì)性進(jìn)食，這是由NPR-1神經(jīng)環(huán)路所調(diào)控的。NPR-1(215F)和NPR-1功能喪失型線蟲會(huì)產(chǎn)生聚集行為，成群聚集在細(xì)菌菌苔的邊緣，而含有NPR-1(215V)的N2線蟲沒有這樣的行為，但對(duì)PA14具有菌落逃逸行為［17］。如圖3所示。

圖3 NPR-1功能喪失型線蟲增加對(duì)PA14的易感性Fig.3 NPR-1 function-loss type elegans promotes munity to PA14

Styer和Reddy兩個(gè)研究組的研究發(fā)現(xiàn)，npr-1突變體（ad609）線蟲比N2線蟲對(duì)PA14的易感性增加［18-19］。為了檢測(cè)N2線蟲和npr-1突變體線蟲(ad609)的運(yùn)動(dòng)行為差異是否會(huì)影響他們對(duì)PA14的易感性，兩個(gè)研究組都利用了滿菌落分析方法。即將PA14涂滿整個(gè)板子，這樣做是為了限制了npr-1突變體線蟲(ad609)成群地聚集在細(xì)菌菌落的邊緣和N2線蟲菌落逃逸行為，然后檢測(cè)這兩種株系線蟲對(duì)PA14的易感性。Reddy等［19］發(fā)現(xiàn)npr-1突變體（ad609）線蟲與N2線蟲相比，對(duì)PA14的易感性無明顯差別，Styer等［18］研究發(fā)現(xiàn)N2線蟲在PA14滿菌落上的死亡率明顯高于在培養(yǎng)基中央涂一塊PA14，而npr-1突變體線蟲（ad609）并沒什么差別。這說明N2線蟲的菌落逃逸行為是造成易感性差異的原因。但同時(shí)，他利用滿菌落發(fā)現(xiàn)npr-1突變體線蟲（ad609）比N2線蟲易受PA14感染，綜合以上結(jié)果他認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)行為的差異只是導(dǎo)致易感性差別的一個(gè)原因而不是全部原因。Styer等［18］還發(fā)現(xiàn)NPR-1調(diào)節(jié)多種固有免疫基因的表達(dá)，因此他認(rèn)為NPR-1不僅可以調(diào)節(jié)線蟲的運(yùn)動(dòng)行為，也可以直接調(diào)節(jié)線蟲的固有免疫來調(diào)控它對(duì)致病菌的易感性。但同時(shí)，Reddy等［19］發(fā)現(xiàn)npr-1突變體在PA14感染后的24h，腸道內(nèi)的積累情況比N2線蟲要嚴(yán)重得多，但在涂滿PA14的測(cè)試條件下沒有區(qū)別。因此他認(rèn)為npr-1突變體（ad609）線蟲和N2線蟲對(duì)致病菌易感性的差異是依賴其行為差異的。為了進(jìn)一步研究NPR-1是否參與調(diào)控固有免疫的靶點(diǎn)基因及其信號(hào)通路，Capra等［20］做了全基因組微陣列分析。結(jié)果表明，npr-1突變以后差別表達(dá)的基因大部分是參與固有免疫調(diào)控的，并且被DAF-16、DBL-1和PMK-1/p38 MAPK信號(hào)通路所調(diào)控。Aballay等［21］發(fā)現(xiàn)PMK-1通路相關(guān)基因在npr-1突變體（ad609）線蟲中的活性遠(yuǎn)低于N2線蟲，全基因組微陣列分析證明了npr-1調(diào)控秀麗線蟲的固有免疫相關(guān)基因，并且不依賴于致病菌的逃逸行為。

NPR-1至少表達(dá)在20多種神經(jīng)元中，包括鳥苷

圖4 插入gcy-32啟動(dòng)子后npr-1突變體線蟲（ad609）對(duì)PA14的易感性降低Fig.4munity of npr-1 mutant elegans to PA14 decline after inserted the gcy-32 promoter

酸環(huán)化酶GCY-35表達(dá)的神經(jīng)元AQR、PQR和 URX，為了證明AQR、PQR和URX參與了NPR-1神經(jīng)環(huán)路對(duì)固有免疫的調(diào)控，Styer等［18］用egl-1表達(dá)在gcy-36啟動(dòng)子（特異性表達(dá)在AQR、PQR和URX）殺死AQR、PQR和URX神經(jīng)元感染PA14后，易感性明顯降低。推測(cè)AQR、PQR和URX神經(jīng)元是可以抑制秀麗線蟲固有免疫反應(yīng)的。此外，他還用gcy-32這個(gè)啟動(dòng)子的特異性啟動(dòng)npr-1在AQR、PQR和URX的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，插入了gcy-32啟動(dòng)子的線蟲對(duì)PA14的易感性降低了，如圖4所示。綜合以上結(jié)果，說明AQR、PQR和URX是通過npr-1神經(jīng)環(huán)路調(diào)節(jié)固有免疫的。

Tiewen Liu等［14］利用激光切除的方式切除URX后，線蟲的壽命從13.3±0.4d下降到10.4±0.4d，和對(duì)照組相比，URX切除的線蟲表型和繁殖行為沒有明顯改變，因此這種壽命的減少并不是由于缺陷。進(jìn)一步研究GCY-35和GCY-36這兩種可以介導(dǎo)URX感受高氧環(huán)境的鳥苷酸環(huán)化酶，發(fā)現(xiàn)GCY-35和GCY-36突變體線蟲的壽命顯著降低。將GCY-35和GCY-36的cDNA分別置于兩者的啟動(dòng)子下發(fā)現(xiàn)突變體的表型得到恢復(fù)。

遺傳學(xué)研究表明NPR-1對(duì)神經(jīng)元AQR、PQR和URX活性的抑制要有可溶性的鳥苷酸環(huán)化酶GCY-35、TAX-2和TAX-4的共同參與，TAX-2和TAX-4蛋白是cGMP門控離子通道的2個(gè)亞基［21］。研究者還發(fā)現(xiàn)這三個(gè)神經(jīng)元的活性能選擇性地被一種鉀離子通道EGL-2功能增強(qiáng)型突變體所抑制，這種突變體也能抑制線蟲的聚集行為。因此推測(cè)這些神經(jīng)元的作用是依賴于cGMP門控離子通道的［18］。

2.3 討論

筆者認(rèn)為，NPR-1至少能從2種機(jī)制抑制固有免疫。NPR-1可以通過調(diào)控線蟲的行為來調(diào)節(jié)它對(duì)致病菌的易感性，也能直接調(diào)節(jié)線蟲的固有免疫反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)為研究高等生物神經(jīng)免疫間的分子交流機(jī)制提供了基礎(chǔ)。哺乳動(dòng)物的NPY可通過交感神經(jīng)系統(tǒng)來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)［22］，雖然線蟲缺乏編碼NPY的基因，但線蟲的基因組可編碼多種作為NPR-1配體的神經(jīng)肽，推測(cè)這些神經(jīng)肽有一些與NPY相似的功能。實(shí)際上，F(xiàn)MRF酰胺相關(guān)神經(jīng)肽FLP-18和FLP-21在調(diào)節(jié)氧傳感中就是NPR-1的內(nèi)源性配體［23］。因此，相關(guān)神經(jīng)肽在固有免疫中的作用有待于進(jìn)一步研究。

3 展望

雖然已有研究表明，線蟲神經(jīng)免疫間的相互作用主要依賴于胰島素信號(hào)通路、多巴胺信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路和NPR-1神經(jīng)環(huán)路，但這些信號(hào)通路的研究仍需深入。例如，npr-1基因具體是如何抑制三個(gè)體液調(diào)控神經(jīng)元的，AQR、PQR和URX三個(gè)神經(jīng)元分別對(duì)固有免疫有什么作用，低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）是否能與GCYs以相似的通路共同調(diào)節(jié)線蟲的固有免疫，等等。Chen D等［24］研究發(fā)現(xiàn)，激活HIF-1能延長(zhǎng)線蟲的壽命，Mehta R等［25］利用HIF-1功能增強(qiáng)型RNAi（去除egl-9，egl-9編碼一種使HIF-1降解的酶）使線蟲的壽命延長(zhǎng)了，利用這種HIF-1功能增強(qiáng)型RNAi能緩解GCY突變體的表型，如圖5所示。相信隨著線蟲神經(jīng)免疫間相互作用的研究不斷深入，最終將為人類高等生物神經(jīng)免疫間的調(diào)節(jié)機(jī)制提供重要的思路和方法。

圖5 HIF-1功能增強(qiáng)型RNAi能緩解GCY突變體的表型Fig.5HIF-1 function enhanced RNAi can relieve the phenotype of GCY mutant

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Research progress of body fluid neurons in the regulation of innate immunity in Caenorhabditis Elegans

MAAn-Ran
（Department ofclinical medicine,School of medicine,Southeast university,Nanjing210000,China）

Caenorhabditis elegans would rapidly activate innate immunity once being infected with pathogens.Neuro-immune interactions which are through the nervous system to release such as neurotransmitters,neuropeptides and hormones to regulate the innate immune response.Those pathways include known dopamine signaling pathway,TGF-β signaling pathway and insulin signaling pathways.Recent studies show that NPR-1 neural circuits are also involved in the regulation of innate immunity and three neurons AQR,PQR and URX exposed to body fluid are under the regulation of NPR-1 neural circuits.Elegans nervous system has only 302 neurons and the structure is relatively simple and the npr-1 gene of elegans can encode GPCR which is similar to the mammalian neuropeptide Y(neuropeptideY,NPY)receptor,providing an edge for studying higher organisms on neuro-immune interactions.Research progress in relation tothe field has been reviewed in present paper.

Caenorhabditis elegans;neuro-immune interactions;NPR-1 neural circuit;neurons exposed to body fluid

Q291

A

1674-8646（2015）09-0008-04

2015-07-15

東南大學(xué)基于教師科研的SRTP項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：T15412007）

馬安然（1994-），女，江蘇南京人，主要從事臨床醫(yī)學(xué)研究。