乳腺癌中VEGF－D的表達(dá)與微血管密度、微淋巴管密度的關(guān)系

段筱娟 李志義△ 楊玉濤 鐘美 饒家秋 何常

（1.貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院病理科，貴州 貴陽(yáng)550002；2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng)550002；3.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，貴州 貴陽(yáng)550001）

乳腺癌的診治取得了重大的進(jìn)步，但轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是造成乳腺癌患者死亡的主要原因。在浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中，微脈管系統(tǒng)的作用不容忽視，經(jīng)血道轉(zhuǎn)移和淋巴道轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要途徑。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D（VEGF－D）是VEGFs成員之一，它可與位于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGFR－2結(jié)合調(diào)節(jié)血管生成，與位于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGFR－3結(jié)合調(diào)節(jié)淋巴管生成，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化法檢測(cè)VEGF－D和 MVD（由CD105標(biāo)記）、MLD（由D2－40標(biāo)記），探討乳腺癌組織中VEGF－D的表達(dá)及其與MVD、MLD、臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例收集 收集2009年1月至2013年12月貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院和貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科存檔病例，乳腺癌50例，收集同期乳腺增生癥10例作對(duì)照。

1.2 免疫組織化學(xué)法染色 采用EnVision二步法分別行VEGF－D和CD105、D2－40染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；3%H2O2去離子水室溫孵育10min；蒸餾水漂洗，置于PBS中震蕩10min；高壓鍋熱修復(fù)；PBS沖洗，滴加一抗，37℃水浴孵育1h；PBS沖洗，滴加二抗，濕盒37℃水浴孵育30min；PBS沖洗，應(yīng)用DAB溶液顯色，顯微鏡下觀察，適時(shí)終止；復(fù)染、脫水、透明、封片。用PBS緩沖液替代一抗作空白對(duì)照，用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照。VEGF－D抗體購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，CD105和D2－40抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，通用型二抗購(gòu)自廣州深達(dá)公司。

1.3 結(jié)果判斷 以乳腺腺上皮細(xì)胞或癌細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒為VEGF－D陽(yáng)性（圖1），采用半定量積分法［1］判斷結(jié)果，每張染色切片隨機(jī)選取5個(gè)染色均勻的高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率，＜5%賦值為0，5%～25%為1，26%～75%為2，≥76%為3。染色程度標(biāo)準(zhǔn)據(jù)每張切片的大多數(shù)細(xì)胞染色特征決定，沒(méi)有染色賦值為0，淺黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3。最終結(jié)果由陽(yáng)性細(xì)胞百分率與染色強(qiáng)度的乘積決定：0～2分為（－），3～4分為（＋），5～7分為（＋＋），8～9分為（＋＋＋）。CD105陽(yáng)性表達(dá)于血管（圖2），D2－40陽(yáng)性表達(dá)于淋巴管（圖3），MVD、MLD計(jì)數(shù)：首先在低倍鏡（×100）下找出脈管比較密集的區(qū)域，即“熱點(diǎn)”區(qū)，然后在高倍鏡（×400）計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域的脈管數(shù)量，取平均值作為MVD、MLD。每張切片選取5個(gè)“熱點(diǎn)”。

圖2 CD105陽(yáng)性表達(dá)于乳腺癌 血管（EnVision法高倍放大）

圖3 D2－40陽(yáng)性表達(dá)于乳腺癌淋巴管 （EnVision法低倍放大）

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件數(shù)據(jù)包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Pearman相關(guān)分析，MVD、MLD用ˉx±s表示，按檢驗(yàn)水準(zhǔn)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料 50例乳腺癌病例的臨床病理特征為：年齡34～84歲，中位年齡49歲，＜50歲25例，≥50歲25例；腫瘤≤2cm 18例，＞2cm 32例；組織學(xué)類(lèi)型均為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，按照WHO乳腺癌病理分級(jí)分：Ⅰ級(jí)4例，Ⅱ級(jí)31例，Ⅲ級(jí)15例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例。

2.2 乳腺癌和乳腺增生癥組織中VEGF－D的表達(dá)及 MVD、MLD VEGF－D的陽(yáng)性表達(dá)率（64.00%）及 MVD（16.96±8）、MLD（2.37±0.91）在乳腺癌組明顯高于乳腺增生癥組（10.00%，1.46±0.67，0.86±0.67），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 VEGF－D、MVD、MLD與乳腺癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 VEGF－D、MVD、MLD與乳腺癌組織學(xué)分級(jí)有相關(guān)性，MVD和MLD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 VEGF－D、MVD、MLD與乳腺癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

2.4 乳腺癌組織中 VEGF－D的表達(dá)與 MVD、MLD之間的關(guān)系 乳腺癌組織中VEGF－D表達(dá)為（－）、（＋）、（＋＋）、（＋＋＋）者 MVD分別為（8.83±3.29）、（17.62±4.31）、（20.75±5.24）、（29.00±6.29），MLD分別為（1.79±0.87）、（2.38±0.55）、（3.00±0.86）、（4.21±0.60），相關(guān)性分析顯示VEGF－D與 MVD、MLD均呈正相關(guān)（P＜0.05）。

3 討 論

乳腺癌淋巴管生成及其轉(zhuǎn)移成為研究熱點(diǎn)。Stacker［2］等發(fā)現(xiàn)VEGF－D可以加快腫瘤生長(zhǎng)和血管生成，而且用抗VEGF－D的抗體可以遏制腫瘤轉(zhuǎn)移。Gu Y［3］等對(duì)61例乳腺癌手術(shù)標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn)，VEGF－D在乳腺癌中的表達(dá)明顯高于乳腺良性病變，癌細(xì)胞VEGF－D高表達(dá)伴有高的淋巴管密度，此類(lèi)患者的預(yù)后也差，提示VEGF－D在乳腺癌的淋巴管形成中發(fā)揮了重要的作用，使癌細(xì)胞更具侵襲性，導(dǎo)致不良的預(yù)后。本實(shí)驗(yàn)中，VEGF－D的表達(dá)及MVD、MLD在乳腺增生癥組中明顯低于乳腺癌組，VEGF－D陽(yáng)性組的 MVD、MVD高于陰性組的，且VEGF－D的表達(dá)水平與 MVD、MLD均呈正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)VEGF－D在脈管的發(fā)育上具有雙重作用，即可以刺激血管內(nèi)皮增殖，又可以促進(jìn)淋巴管生成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示乳腺癌低分化組的MVD、MLD高于中、高分化組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的MVD、MLD高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明乳腺癌組織內(nèi)的MVD、MLD與腫瘤細(xì)胞的分化程度、侵襲能力和淋巴轉(zhuǎn)移均有一定的關(guān)系，腫瘤MVD、MLD較高者，有較強(qiáng)的侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力。但是VEGF－D陽(yáng)性率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，分析原因可能是：（1）VEGF－D在不同腫瘤內(nèi)酶解加工的程度不同；（2）VEGF－D雖然在腫瘤中可刺激淋巴管生成，但在淋巴系統(tǒng)的發(fā)展過(guò)程中VEGF－D不起重要作用或者是在發(fā)展過(guò)程中同時(shí)存在其他淋巴管生長(zhǎng)因子的調(diào)控機(jī)制，補(bǔ)償了 VEGF－D的作用［4］。故 VEGF－D參與了乳腺癌血管和淋巴管生成。MVD和MLD與腫瘤的分化程度、侵襲能力和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)預(yù)后和轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。

［1］ 邢傳平，劉斌，董亮.免疫組織化學(xué)標(biāo)記結(jié)果的判斷方法［J］.中華病理學(xué)雜志，2001，30（4）：318.

［2］ Stacker SA，Caesar C，Baldwin ME，et al.VEGF－D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics［J］.Nat Med，2001，7（2）：186－191.

［3］ Gu Y，Qi X，Guo S，et al.Lymphangiogenesis induced by VEGF－C and VEGF－D promotes metastasis and a poor outcome in breast carcinoma retrospective study of 61cases［J］.Clin Exp Metastasis，2008，25（7）：717－725.

［4］ Baldwin M E，Halford M M，Roufail S，et al.Vascular endothelial growth factor D is dispensable for development of the lymphatic sydtem［J］.Mol Cell Biol，2005，25（6）：2441－49.