貴陽地區(qū)兒童幽門螺桿菌臨床分離菌株毒力基因cagA和vacA的表達(dá)情況以及與抗生素耐藥之間的關(guān)系

秦丹 朱莉 龍梅 熊妍 劉文莉 全小麗

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院研究生院兒科，貴州 貴陽550004；2.貴陽市兒童醫(yī)院，貴州 貴陽550003）

幽門螺旋桿菌（helicobacter pylori，Hp）是慢性活動性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)性淋巴組織淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。兒童體內(nèi)Hp菌的cagA基因和vacA基因的研究還未見報道，因此本研究對于貴陽地區(qū)兒童HP臨床分離菌株的基因型進(jìn)行研究。Hp的根除治療目前主要用的是標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)療法，耐藥菌株的產(chǎn)生是Hp根除治療失敗的主要原因。而關(guān)于毒力基因與耐藥之間的關(guān)系，目前國內(nèi)關(guān)于兒童的研究報道較少，故本實驗將對兩者的關(guān)系進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2013年5月至2014年7月因上消化道癥狀于貴陽市兒童醫(yī)院行胃鏡檢查的患兒。選取快速尿素酶試驗陽性的患兒的胃竇粘膜標(biāo)本，共283例，培養(yǎng)出31例，年齡3～14歲，男22例，女9例，平均年齡8.13±2.86歲。所有患兒4周內(nèi)未使用抗生素、鉍劑及質(zhì)子泵抑制劑。標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11637由貴陽醫(yī)學(xué)院微生物教研室提供。

1.2 主要器材與試劑

幽門螺桿菌選擇性添加劑（OXOID，英國），微需氧產(chǎn)氣袋（Mitsubishi，Japan），甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、左氧氟沙星藥品粉末均購于中國藥品生物制品檢定所。細(xì)菌DNA提取試劑盒購于北京天根生公司，16srRNA引物及cagA和vacA基因亞型引物參照文獻(xiàn)由生工生物工程（上海）股份有限公司 合 成，cagA［1］的 上 游 GATAACAGGCAAGCTTTTGAG，下游 CTGCAAAAGATTGTTTGGCAGA。VacA各基因亞型的序列分別為slars，上 游 GTCAGCATCACACCGCAAC 下 游CTGCTTGAATGCGCCAAAC，slb上游 AGCGCCATACCGCAAGAG 下 游 CTGCTTGAATGCGCCAAAC，slcCTCGCTTTAGTGGGGCTA下游CTGCTTGAATGCG CCAAA，ml上游GGTCAAAATGCGGTCATGG下游CCATTGGTACCTGTAG AAAC，m2 上 游 GGAGCCCCAGGAAACATTG下 游 CATMCTAGCGCCTTGCAC［2］。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)本的培養(yǎng)與鑒定 剪將胃竇粘膜組織剪碎后將組織漿液接種在哥倫比亞培養(yǎng)基上以后置于微需氧環(huán)境37℃ 培養(yǎng)3～5d，挑選針尖大小透明水滴樣可疑幽門螺桿菌菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并且提取DNA進(jìn)行16s鑒定。具體方法參照《貴州省幽門螺桿菌臨床菌株的分離培養(yǎng)》［3］。

1.3.2 PCR檢測毒力基因cagA及vacA基因亞型cagA基因的PCR，反應(yīng)體系為2×Taq PCR Master－Mix 12.5ul，上下游引物各0.6ul，模板 DNA0.8ul，余下用雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)足至25ul。反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性5min；94℃變性30s，53℃復(fù)性30s，72℃ 延伸30s，共30個循環(huán)；最后72℃保溫5min。s1a，m1和m2的反應(yīng)條件和體系相同：反應(yīng)體系為2×Taq PCR MasterMix 12.5ul，上下游引物各0.6ul，模板DNA1ul，余下用雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)足至25ul。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，54℃復(fù)性20s，72℃延伸30s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸5min。s1b和s1c反應(yīng)體系為2×Taq PCR Master－Mix 12.5ul，上下游引物各1ul，模板 DNA2ul，余下用雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)足至25ul。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，53℃復(fù)性30s，72℃延伸30s，共30個循環(huán)；最后72℃保溫5min。所有反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳后G：BOX凝膠成像系統(tǒng)拍照鑒定。

1.3.3 抗生素耐藥率的測定 采用瓊脂稀釋法，配置不同藥物及藥物濃度的含血MH培養(yǎng)基，微需氧條件下37℃培養(yǎng)3天，結(jié)果參照NCCLS標(biāo)準(zhǔn)鑒定。阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星 MIC≥1μg／mL，甲硝唑 MIC≥32μg／ml判定為耐藥菌株。以標(biāo)準(zhǔn)菌株NC11637作為質(zhì)控菌株。每次試驗均設(shè)不含藥的平板作為陰性對照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行χ2檢驗，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 cagA基因及vacA基因亞型PCR結(jié)果 從31株幽門螺桿菌菌株中，共有26例菌株含cagA基因，陽性率為83.87%。vacA各基因亞型的檢出率分別為：s1a（22／31，70.97%），s1c（6／31，19.35%），m1（4／31，12.90%），m2（19／31，61.29%），31株幽門螺桿菌中未檢測到s1b亞型。vacA基因亞型s1a，s1b，s1c，m1和 m2的檢出率分別為83.87%（22／31），0% （0／31），19.35%（6／31），12.90%（4／31）和74.19%（19／31）。各組合的檢出率為：s1a／m2型48.39%（15／31），s1a／m1型6.45%（2／31），s1a＋s1c／m2的12.90%（4／31），s1a型12.90%（4／31），s1c／m2 型6.45%（2／31），m1型3.23%（1／31），m2型6.45%（2／31），有1例同時有 m1和 m2型。各基因的凝膠電泳結(jié)果見圖1至圖5。

圖1 cagA基因電泳圖

圖2 vacA基因亞型s1a電泳圖

圖3 vacA基因亞型s1c電泳圖

圖4 vacA基因亞型m1電泳圖

圖5 vacA基因亞型m2電泳圖

2.2 耐藥情況 貴陽地區(qū)兒童幽門螺桿菌對阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星的耐藥率分別為16.13%（5／31）、19.35%（6／31）、41.94% （13／31）和12.90%（4／31）未發(fā)現(xiàn)多重耐藥菌株。甲硝銼的耐藥率大于阿莫西林（P＜0.05）和左氧氟沙星（P＜0.05），其他抗生素耐藥性之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。。

表1 貴陽地區(qū)兒童幽門螺桿菌不同抗生素耐藥率

2.3 毒力基因與抗生素的耐藥性 用Fischer確切概率分析cagA基因與各種抗生素耐藥性之間的關(guān)系，未發(fā)現(xiàn)其與阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑及左氧氟沙星耐藥性之間有相關(guān)性（P＞0.05）。毒力基因與抗生素之間無相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討 論

幽門螺桿菌的不同的基因會引起不同的臨床轉(zhuǎn)歸，有學(xué)者根據(jù)cagA的有無及vacA的基因型，將幽門螺桿菌分為兩類，Ⅰ型菌株主要為cagA＋／s1m1vacA，感染后與潰瘍和癌癥有關(guān)，Ⅱ型菌株為cagA－／s2m2vacA，通常表現(xiàn)為無癥狀胃炎。cagA基因可表達(dá)CagA蛋白，因此，cagA可作為Hp毒力強(qiáng)弱的標(biāo)志，CagA陽性的為高毒力菌株。西方國家約50～70%的幽門螺旋桿菌是cagA陽性的菌株。本實驗的結(jié)果提示cagA的陽性率為83.87%，說明本地區(qū)的感染以cagA＋為主，表明毒力較強(qiáng)。vacA基因有著很明顯的地域差異性，不同的基因分型的毒力也不相同，以s1a／m1毒力最強(qiáng)，s2／m2毒力最弱。不同的國家和地區(qū)的分布不同，VacA亞型在北歐和東歐以s1a型為主。北美及中南歐S1a和S1b大致相等。中南美S1b為主，日本S1a為主，m1和m2世界各地分布大致相同。在本實驗中，vacAs1a陽性率為70.97%，vacAsm2的陽性率為61.29%，而s1am2基因型的檢出率為35.48%，高于其他基因組合，表明本地區(qū)的兒童幽門螺桿菌感染vacA基因亞型以s1am2為主，與該地區(qū)成人的檢出結(jié)果相同［4］。實驗結(jié)果還提示，有1株細(xì)菌同時有m1和m2亞型，而這兩種亞型不可能同時出現(xiàn)在一種Hp菌株中，提示可能為混合感染。

實驗針對本地區(qū)的兒童幽門螺桿菌臨床分離菌株進(jìn)行阿莫西林、克拉霉素，甲硝唑，左氧氟沙星的耐藥性進(jìn)行檢測，均發(fā)現(xiàn)了耐藥菌株。目前對于耐藥性的產(chǎn)生多在分子研究上。幽門螺旋桿菌的克拉霉素耐藥性的產(chǎn)生與23SrRNA V區(qū)DNA序列突變關(guān)系密切［5］。Kwon等研究表明Hp對甲硝唑耐藥性與編碼參與甲硝唑氧化還原反應(yīng)酶的rdxA基因突變有關(guān)，由于基因突變導(dǎo)致酶表達(dá)的缺失或者酶的活性降低，從而不能有效地將甲硝唑還原成有細(xì)胞毒性的還原產(chǎn)物，最終導(dǎo)致Hp對甲硝唑耐藥［6］。阿莫西林的耐藥還較為少見。有研究顯示其耐藥的產(chǎn)生與青霉素結(jié)合蛋白－1（PBPs－1）的突變相關(guān)。喹諾酮類還較少用于幽門螺桿菌的根除治療，其耐藥的產(chǎn)生主要與gyrA基因相關(guān)［7］。

而目前幽門螺桿菌毒力基因與其耐藥性是否有關(guān)，國內(nèi)外還沒有定論。Taneike I等的研究認(rèn)為CagA陽性的菌株對甲硝唑更敏感［8］。Adnan Khan等認(rèn)為CagA與幽門螺桿菌耐藥性的產(chǎn)生有密切的聯(lián)系［9］。英國的Elviss等認(rèn)為耐藥性與VacAs1m1有關(guān)。Toro C等認(rèn)為CagA＋的菌株對抗生素的敏感度更高［10］。許國艷等研究表明cagA基因陽性同時存在著rdxA基因變異的菌株能引起幽門螺桿菌對甲硝唑高水平耐藥性。KarabiberH等的研究認(rèn)為vacslc陰性的菌株中，克拉霉素的耐藥菌株較多，而在vacAsl和vacAslc陽性的菌株中，甲硝唑更容易發(fā)生耐藥［11］。意大利的 De Francesco viiS的研究以及我國胡偉國等對兒童Hp菌的基因型與耐藥性的關(guān)系研究提示毒力基因與耐藥性之間并無相關(guān)性。本研究cagA基因的檢出率為83.87%，CagA＋和CagA－的菌株與阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星的耐藥性之間無相關(guān)性，其P值分別0.173、0.313、0.659和0.475。在 VacA基因亞型中，sla、slc、m1和m2與阿莫西林耐藥性差異（P＝0.387，0.687，0.525，0.615）、克拉霉素耐藥性差異（P＝0.687、0.069，0.402，0.503）、甲硝唑耐藥性差異（P＝0.083，0.501，0.434，0.448）、左氧氟沙星耐藥性差異（P＝0.095，0.402，0.442，0.268）之間無相關(guān)性。在現(xiàn)有的研究中，不同國家和地區(qū)的研究提示不同的結(jié)果，有的提示毒力基因陽性的耐藥性更強(qiáng)，而有的則是陰性的耐藥性更強(qiáng)，不同的基因型組合也與耐藥性有不同的相關(guān)性，而不同的藥物之間與毒力基因的耐藥性也不盡相同。這可能與不同國家和地區(qū)的毒力基因的分型的不同相關(guān)。也可能不同藥物的耐藥的發(fā)生與毒力基因存在染色體上的關(guān)聯(lián)作用。

綜上所述，貴陽地區(qū)兒童幽門螺桿菌的的毒力基因主要以cagA＋和slam 2vacA為主。毒力基因cagA和vacA基因與抗生素耐藥性之間無相關(guān)性。還需擴(kuò)大樣本量研究尋找兩者之間的關(guān)系，為攜帶不同毒力基因類型幽門螺桿菌的感染的抗生素選擇上提供理論依據(jù)。

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