IL－17，IL－6，IL－1β與兒童原發(fā)性腎小球疾病的相關(guān)性研究

賀麗蓉 邵曉珊 李宇紅 蔣新輝 徐海霞 應(yīng)蓓 邱杰 鄭莎莎 林俊

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽550004；2.貴陽市兒童醫(yī)院腎臟免疫科，貴州 貴陽550003）

原發(fā)性腎小球疾?。╬rimary glomerular diseases）在我國腎臟疾病譜中占有重要的地位，是一組原因不明的免疫炎癥反應(yīng)性疾病，有相似的臨床表現(xiàn)如蛋白尿、血尿、高血壓、不同程度的水腫以及腎功能損害，也是兒童時(shí)期最常見的慢性腎臟疾病之一，其確切病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。近年研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞（T help 17cells）在自身免疫性疾病發(fā)病過程中起著重要作用［1］。白細(xì)胞介素－17（interleukin－17，IL－17）、IL－6和IL－1β是與 Th17細(xì)胞密切相關(guān)的三種細(xì)胞因子，多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等患者血漿或病變組織中IL－17或IL－6、IL－1β表達(dá)增高，推測其可能參與了這些疾病的發(fā)病過程［2－3］。原發(fā)性腎小球疾病是常見的自身免疫性疾病。本研究旨在通過檢測IL－17、IL－6和IL－1β的表達(dá)，探討它們在原發(fā)性腎小球疾病中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集貴陽市兒童醫(yī)院腎臟科2013年12月至2014年12月住院的30例確診為原發(fā)性腎小球疾病患兒臨床資料。男20例，女10例；發(fā)病年齡1.58～14歲，平均（8.2±3.8）歲。其中腎炎型腎病綜合征10例，單純型腎病綜合征10例，腎小球腎炎9例，孤立性血尿1例。同時(shí)收集10例健康體檢兒童外周血作為正常對照，男8例，女2例，平均（5.9±3.3）歲。本研究經(jīng)貴陽市兒童醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意，符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，家屬知情同意。

1.2 診斷與分型標(biāo)準(zhǔn)

所有病例臨床診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會腎臟病學(xué)組2000年11月珠海會議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］，均排除紫癜性腎炎、狼瘡性腎炎、乙肝病毒相關(guān)性腎炎等繼發(fā)性腎臟疾病及其它免疫性疾病，且均無腎臟病家族史。

1.3 方法

1.3.1 熒 光 定 量 PCR（Real－time PCR）檢 測IL－17mRNA的表達(dá) 主要試劑為核酸提取試劑盒（CW0582，康為世紀(jì)），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（C28025－032，Invitrogen公司），2×UltraSYBR Mixture（CW0956，康為世紀(jì)）。根據(jù)核酸提取試劑盒說明書提供的方法提取血液總RNA。提取后用紫外分光光度計(jì)測定所提取RNA的濃度和純度，所有用于逆轉(zhuǎn)錄的樣品要求比值在1.9～2.1之間。再按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的方法，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。制備的cDNA于－20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ缓蟛捎肧YBR Green I嵌合熒光法，應(yīng)用美國Applied Biosystems Stepone Plus熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測。根據(jù) NCBI Gene Bank中人的IL－17的mRNA序列，采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)（primer5.0）相關(guān)引物，由上海生工生物工程技術(shù)設(shè)計(jì)合成、純化。引物序列為：IL－17上游：5＇－GAGAAGATACTGGTGTCCGTGG－3＇，下游：5＇－TGAGTTTAGTCCGAAATGAGGC－3＇（產(chǎn)物大?。?71bp）；GAPDH 上游：5＇－TGGACCTGACCTGCCGTCTAG－3＇， 下 游：5＇－AGGAGTGGGT－GTCGCTGTTGA－3＇（產(chǎn)物大小：150bp）。擴(kuò)增結(jié)束后應(yīng)用Stepone Software v2.1分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)算目的基因IL－17的相對表達(dá)量。

1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血漿中細(xì)胞因子IL－17、IL－1β及IL－6的表達(dá) 收集所有受試者清晨空腹肝素或EDTA抗凝血，收集標(biāo)本后30min內(nèi)2500rpm離心5min，分離獲得血漿。采用ELISA法檢測血漿中IL－17、IL－1β及IL－6的含量，操作嚴(yán)格按照試劑書說明書進(jìn)行。ELISA試劑盒購自杭州聯(lián)科試劑公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，運(yùn)用t檢驗(yàn)；P＜0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Real－time PCR檢測外周血中IL－17mRNA 的表達(dá) IL－17及GAPDH的PCR擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，指數(shù)期明顯，擴(kuò)增曲線整體平行性好，基線平無上揚(yáng)現(xiàn)象，說明擴(kuò)增良好：溶解曲線均為單峰，峰型銳利，其他位置無明顯波形，表明擴(kuò)增產(chǎn)物單一，特異性好。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組IL－17mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組（P＜0.05）。見圖1～3及表1。

圖1 IL－17的擴(kuò)增曲線（a）和溶解曲線（b）（Tm：83.66℃）

圖2 GAPDH 的擴(kuò)增曲線（a）和溶解曲線（b）（Tm：83.52℃）

表1 各組外周血中IL－17mRNA的表達(dá)（±s）

表1 各組外周血中IL－17mRNA的表達(dá)（±s）

相對表達(dá)對照組組別 n IL－17mRNA 10 1.095±0.212實(shí)驗(yàn)組 30 4.427±2.870 t 3.636 P＜0.05

圖3 各組外周血中IL－17mRNA的表達(dá)

2.2 ELISA 檢測血漿IL－17、IL－1β以及IL－6的表達(dá) 原發(fā)性腎小球疾病患兒血漿中IL－17、IL－1β以及IL－6的含量均明顯高于正常對照組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2及圖4。

表2 各組血漿中IL－17、IL－1β以及IL－6的水平比較 （pg／mL）

圖4 各組血漿中IL－17、IL－1β以及IL－6的水平比較（pg／mL）

3 討 論

Th17細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)不同于Th1和Th2細(xì)胞的Th細(xì)胞亞群。研究表明［5］，Th17細(xì)胞參與調(diào)節(jié)和控制免疫應(yīng)答，在自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用。IL－17、IL－1β、IL－6、IL－23和 RORγt等在Th17細(xì)胞發(fā)育、增殖及發(fā)揮效應(yīng)方面起重要作用［6］。

IL－17是Th17細(xì)胞分泌的主要效應(yīng)細(xì)胞因子，其受體分布于體內(nèi)多種組織，是一種強(qiáng)大的前炎癥細(xì)胞因子，也是炎癥反應(yīng)的微調(diào)因子，通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞聚集，誘導(dǎo)細(xì)胞釋放前炎癥因子，引起炎癥細(xì)胞浸潤和組織損傷，參與腎臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展，在宿主抗細(xì)菌感染免疫中發(fā)揮重要作用［7－10］。它在慢性炎癥疾病及自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中的作用也成為了研究熱點(diǎn)［11－12］。IL－17作為Th17細(xì)胞的特異性效應(yīng)因子，本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對原發(fā)性腎小球疾病患兒外周血IL－17mRNA水平進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)IL－17mRNA水平高于正常對照組，結(jié)果較普通PCR更精確，特異性更高，證實(shí)了原發(fā)性腎小球疾病患兒外周血中存在IL－17的異?；罨?，加重了免疫反應(yīng)的發(fā)生。

研究表明，IL－6，IL－23及IL－1β同時(shí)存在能刺激初始 CD4＋T 細(xì)胞大量分泌IL－17［13］。IL－17又能夠促進(jìn)多種細(xì)胞，如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等分泌IL－1、IL－6等炎癥因子，并且能夠與之協(xié)同，放大局部炎癥效應(yīng)［14］。IL－1β是一種重要的促炎癥因子，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞浸潤和其他炎癥因子產(chǎn)生，加重炎癥反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，IL－1β可刺激腎小球系膜細(xì)胞活化和增殖，在腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用［15］。本研究通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)患兒血漿中IL－17、IL－1β以及IL－6的表達(dá)水平均明顯增強(qiáng)，提示Th17相關(guān)致炎因子IL－17、IL－1β以及IL－6參與了原發(fā)性腎小球疾病的發(fā)病過程。

IL－1β、IL－6作為 Th17細(xì)胞的上游刺激因子配合IL－17作為Th17細(xì)胞的下游刺激因子。我們的研究結(jié)果顯示，外周血中核酸水平增高同時(shí)血漿中IL－17、IL－1β以及IL－6的表達(dá)水平均明顯增強(qiáng)，說明Th17細(xì)胞的相關(guān)炎性因子的異?；罨赡軈⑴c了原發(fā)性腎小球疾病的發(fā)病過程，但其與腎臟疾病的嚴(yán)重程度是否有關(guān)聯(lián)還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量同時(shí)配合腎組織病理檢查進(jìn)行分析。既往有研究報(bào)道在 原 發(fā) 性 腎 病 綜 合 征 （primary nephrotic syndrome，PNS）患兒腎組織中IL－17表達(dá)的陽性率微小病變組高于正常對照組，提示IL－17在兒童PNS的發(fā)生及大量蛋白尿的形成方面有顯著作用；腎組織上IL－6的表達(dá)在微小病變組較正常對照組無明顯差別，但在非微小病變組明顯升高，提示IL－6在兒童PNS的慢性腎臟病進(jìn)程中可能有重要作用，但與兒童PNS的發(fā)病可能關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)［16］。

隨著基礎(chǔ)和臨床研究的不斷深入，越來越多的數(shù)據(jù)表明Th17細(xì)胞相關(guān)炎性因子在一些類型的腎臟炎癥性疾病的發(fā)病過程中起重要作用，特異性針對Th17細(xì)胞相關(guān)炎性因子的治療可能是治療腎臟疾病的新靶點(diǎn)［17］。但是Th17在原發(fā)性腎小球疾病中的具體發(fā)病機(jī)制還不清楚，還需要大量深入的研究去進(jìn)一步闡明Th17細(xì)胞及其相關(guān)炎性因子對原發(fā)性腎小球疾病的作用及機(jī)制，從而為治療原發(fā)性腎小球疾病開辟新的道路。

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