貴州地區(qū)丙型肝炎患者病毒基因型與外周血輔助性T細(xì)胞因子表達(dá)相關(guān)性研究

梁躍東 楊興林 洪章萍 熊金鳳 黃海

（1.貴陽(yáng)市第五人民醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng)550004；2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，貴州 貴陽(yáng)550004）

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染后約80%發(fā)展為慢性肝炎，約25%發(fā)展為肝硬化、肝癌［1］。引起丙肝慢性化的重要原因之一是宿主免疫功能的變化，其中T淋巴細(xì)胞及其所分泌的細(xì)胞因子的變化顯著影響了感染的進(jìn)程。因此了解近年來(lái)貴州地區(qū) HCV流行株的基因型，了解HCV感染過(guò)程中T淋巴細(xì)胞及其細(xì)胞因子的變化，對(duì)臨床治療具有指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇貴陽(yáng)市第五人民醫(yī)院2011年10月至2013年7月傳染科門診和住院患者中HCV RNA為陽(yáng)性的慢性丙肝患者198例，其中男109例，女89例，年齡20～74歲；診斷均符合2004年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)《丙型肝炎防治方案》，所有患者的抗－HCV檢測(cè)為陽(yáng)性，且排除其他類型肝炎病毒感染，均未使用過(guò)干擾素和其他免疫調(diào)節(jié)劑。45例健康對(duì)照標(biāo)本來(lái)自本院健康體檢人群。

1.2 HCV－RNA定量檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量（RQ－PCR）法，采用上?？迫A股份有限公司生產(chǎn)的HCV熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)，靈敏度為5×102IU／mL。

1.3 HCV基因分型 用異硫氰酸胍（Trizol）－氯仿－異丙醇抽提血清中的HCV RNA，用75%的乙醇洗滌RNA沉淀，15μL DEPC水溶解核酸－70℃保存或立即冰浴備用。依據(jù)HCV Core－E1區(qū)核苷酸序列合成4條引物，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為：CEI－ESP 5’－GCAACAGGGAACCTTCCTGGTTGCTC－3’，CEI－EAP 5’－CGTAGGGGACCAGTTCATCATCAT－3’，CEI－ISP 5’－AACCTTCCTGGTTGCTCTTTCTCTAT－3’，CEI－IAP 5’－GT－TCATCATCATATCCCATGCCAT－3’。逆轉(zhuǎn)錄及首輪PCR同時(shí)進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：42℃40min；94℃15s，60℃15s，72℃30s，共擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，得到外擴(kuò)增PCR產(chǎn)物。取2μL為模板，進(jìn)行第2輪PCR反應(yīng)，PCR循環(huán)參數(shù)與首輪相同，得到內(nèi)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增片段為474bp。PCR產(chǎn)物置1.5%的瓊脂糖電泳20min，凝膠成像分析儀觀察結(jié)果。取陽(yáng)性PCR產(chǎn)物，用Promega的PCR DNA純化體系進(jìn)行純化，送北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序，CEl－ISP作為測(cè)序引物。

1.4 細(xì) 胞 因 子 檢 測(cè) 血 清IL－2、IL－8、IL－10 和TFN－α檢測(cè)采用ELISA法，試劑盒購(gòu)自生物晶美工程有限公司，按試劑盒說(shuō)明方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，年齡、血清細(xì)胞因子水平數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)，以（ˉx±s）表示，性別資料用χ2檢驗(yàn)，不同基因型細(xì)胞因子水平比較用F檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 198份丙型肝炎患者HCV基因分型 結(jié)果顯示，1a型4例（2.02%），1b 型71例（35.86%），2a型9例（4.55%），3a型29例（14.65%），3b型47例（23.74%），6a 型 37 例 （18.69%），6d 型 1 例（0.50%）。

2.2 慢性丙型肝炎患者血清細(xì)胞因子水平與正常對(duì)照組的比較 198例慢性丙型肝炎患者血清細(xì)胞因子水平與正常對(duì)照組比較結(jié)果見(jiàn)表1，血清IL－8與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而慢性丙型肝炎患者血清IL－2、IL－10、TNF－α與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 慢性丙型肝炎患者血清細(xì)胞因子水平與正常對(duì)照組比較 （pg／mL）

2.3 慢性丙型肝炎患者不同基因型細(xì)胞因子水平比較 184例不同基因型之間細(xì)胞因子水平的結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)IL－2與TNF－α在各基因型間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL－8在lb型患者血清中含量與3a、3b、6a型患者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），3a、3b、6a型患者血清中IL－8含量?jī)蓛杀容^差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；IL－10在lb型患者血清中含量與3a、3b、6a型患者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），3a、3b、6a型患者血清中IL－10含量?jī)蓛杀容^差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。1a、2a、6a檢測(cè)例數(shù)較少未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。見(jiàn)表2。

表2 丙型肝炎患者不同基因型細(xì)胞因子水平比較

3 討 論

慢性丙肝感染可導(dǎo)致肝硬化、原發(fā)性肝癌，但發(fā)病機(jī)制尚不明確。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，宿主免疫應(yīng)答在HCV感染的慢性化中，尤其是Th1／Th2相關(guān)因子表達(dá)失衡在丙型肝炎發(fā)病機(jī)制中可能起重要作用［2－3］。細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CTL）是主要的效應(yīng)細(xì)胞，激活的CTL細(xì)胞通過(guò)釋放穿孔素和Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑清除病毒，同時(shí)導(dǎo)致肝細(xì)胞炎癥壞死。CTL細(xì)胞需在Th細(xì)胞輔佐下才能充分發(fā)揮作用。Th細(xì)胞即輔助性T淋巴細(xì)胞，前體Th0細(xì)胞可分化為Th1／Th2兩個(gè)優(yōu)勢(shì)亞型，Thl細(xì)胞主要分泌IL－2、IL－12、IFN 、TNF等，能促進(jìn)細(xì)胞免疫，對(duì) CTL的功能有輔佐作用；Th2細(xì)胞主要分泌IL－4、IL－5、IL－6、IL－10等，對(duì) Th1細(xì)胞有抑制作用，它抑制細(xì)胞免疫，增強(qiáng)體液免疫，細(xì)胞因子水平和Thl／Th2優(yōu)勢(shì)亞群兩者互相影響，互為因果。Thl細(xì)胞有利于病毒的清除而Th2細(xì)胞主要與組織損傷及慢性化有關(guān)。Thl細(xì)胞與Th2細(xì)胞之間的活性的平衡決定了感染的結(jié)局及臨床表現(xiàn)，進(jìn)而影響HCV感染者的慢性化和臨床轉(zhuǎn)歸。

本文結(jié)果顯示，慢性丙型肝炎與正常對(duì)照組比較，丙型肝炎患者體內(nèi)存在Th1型細(xì)胞因子分泌IL－2、TNF－α明顯降低，Th2型細(xì)胞因子分泌IL－10增高，可抑制宿主的細(xì)胞免疫功能，使機(jī)體不能清除病毒，可能是HCV感染慢性化的重要機(jī)制，與相關(guān)報(bào)道［4－5］相符。分析以上研究結(jié)果可知，CHC患者體內(nèi)Th2類細(xì)胞因子均呈高表達(dá)狀態(tài)，Th1類細(xì)胞因子表達(dá)情況的報(bào)道尚不完全一致，可能與收集病例樣本有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)IL－2、TNF－α表達(dá)較低的現(xiàn)象，CHC患者Th1類細(xì)胞因子表達(dá)受到抑制，而Th2類細(xì)胞因子高表達(dá)，可能Th1類細(xì)胞因子水平低下是導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫功能缺陷、使病毒清除障礙及感染慢性化的原因之一。

目前干擾素－a聯(lián)合利巴韋林（RBV）是公認(rèn)治療慢性丙型肝炎有效的藥物，能有效抑制患者HCV復(fù)制，減輕肝臟炎癥壞死和肝纖維化。在治療前評(píng)估、療效預(yù)測(cè)及個(gè)體化療程，其中基因型最為重要，目前多數(shù)指南推薦基本療程為：基因1型48周，基因2／3型24周［6］。近年來(lái)，相關(guān)的研究結(jié)果顯示，在治療過(guò)程中Thl／Th2類相關(guān)因子均有不同的變化，賈紅宇等［7］對(duì)24例HCV攜帶者和27例CHC患者血清IL－18和IL－10水平的研究發(fā)現(xiàn)，CHC患者該兩種細(xì)胞因子水平明顯高于正常對(duì)照組和HCV攜帶組，27例CHC患者經(jīng)干擾素－a治療6個(gè)月后IL－18和IL－10水平較治療前明顯降低。血清中IL－10水平由高到低依次為：治療無(wú)應(yīng)答組＞部分應(yīng)答組＞完全應(yīng)答組。胡敏濤等［8］報(bào)道用聚乙二醇干擾素a－2b治療的慢性丙型肝炎患者58例，用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)治療前后患者血清INF－r、IL－2、IL－6、IL－10的變化，治療48周后應(yīng)答組與無(wú)應(yīng)答組比較，INF－r、IL－2水平均顯著升高，IL－6、IL－10水平則顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。慢性丙型肝炎患者血清IL－8含量明顯增高，IL－8能降低2’－5寡腺苷合成酶活性，抑制內(nèi)源性IFN－a的合成，有研究證明，NS5A基因的刺激可使IL－8的合成增加8～12倍，發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3和NS4抗體水平與病毒血癥程度無(wú)相關(guān)性，高水平病毒血癥患者的抗－NS5抗體顯著增高，說(shuō)明NS5蛋白是激活HCV復(fù)制的重要因子。以上研究結(jié)果表明，某些細(xì)胞因子，特別是IL－2、IL－10、IL－8、TNF等的水平，可做為CHC預(yù)后和預(yù)測(cè)IFN治療效果的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)CHC患者血清IL－2、IL－10、IL－8、TNF－a及基因型檢測(cè)，結(jié)果顯示在治療前CHC患者1b型中外周血IL－8、IL－10明顯高于3a、3b、6a型，提示1b型患者抗病毒治療效果不佳的因素之一。在基因型與細(xì)胞因子的關(guān)系報(bào)道較少，在不同基因型CHC患者抗病毒治療過(guò)程中細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化正做進(jìn)一步研究。

總之，丙型肝炎的顯著臨床特點(diǎn)就是極易慢性化，而T淋巴細(xì)胞以及細(xì)胞因子在HCV感染慢性化中起著重要作用，Thl／Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平不但與丙型肝炎的慢性化和疾病進(jìn)程有關(guān)，而且與IFN療效關(guān)系密切。HCV基因型對(duì)于肝損傷、疾病進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸的影響尚有不同觀點(diǎn)，不同基因型與HCV感染后的病情變化以及干擾素的療效有一定相關(guān)性。如何能把基因型與相關(guān)細(xì)胞因子水平的變化在預(yù)測(cè)丙型肝炎的診斷、治療和預(yù)防，規(guī)范檢測(cè)方法，仍需進(jìn)一步深入研究。

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