棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒感染對(duì)宿主昆蟲(chóng)GST活性及其表達(dá)水平的影響

黃詩(shī)迪，黃彩萍，于 歡，王 敦

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌712100)

棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒感染對(duì)宿主昆蟲(chóng)GST活性及其表達(dá)水平的影響

黃詩(shī)迪，黃彩萍，于 歡，王 敦

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌712100)

【目的】 研究棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒(HearNPV)感染宿主昆蟲(chóng)后對(duì)宿主谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性與基因表達(dá)水平的影響，明確病毒在侵染宿主過(guò)程中對(duì)宿主昆蟲(chóng)GST的調(diào)控作用?！痉椒ā?采用50和100 PIB/只2種劑量的HearNPV病毒感染3齡棉鈴蟲(chóng)，測(cè)定感染后不同時(shí)間試蟲(chóng)中腸GST活性與其編碼基因的表達(dá)水平，對(duì)比分析病毒感染與未感染健康試蟲(chóng)的GST活性及其編碼基因表達(dá)水平的差異。【結(jié)果】 棉鈴蟲(chóng)在HearNPV感染初期，GST活性顯著提高，同時(shí)GST表達(dá)水平顯著上調(diào)；隨著感染時(shí)間的推移，GST活性與其編碼基因的表達(dá)水平均顯著下降，表明病毒感染后對(duì)宿主昆蟲(chóng)GST活性的影響與其對(duì)GST表達(dá)水平的調(diào)控相關(guān)?！窘Y(jié)論】 HearNPV感染棉鈴蟲(chóng)過(guò)程中，病毒入侵能夠激活宿主GST基因的表達(dá)，但病毒的持續(xù)感染最終會(huì)抑制GST編碼基因的表達(dá)水平。

棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒(HearNPV)；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)；GST基因；表達(dá)水平

棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒(Helicoverpaarmigeranucleopolyhedrovirus，HearNPV)是重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)的特異性病原微生物，具有專一、高效的防治效果。截至目前，國(guó)內(nèi)已經(jīng)獲得HearNPV全基因組序列的毒株有C1和G4 2個(gè)分離株[1-2]，在其功能基因組學(xué)和生物防治方面取得了顯著的研究進(jìn)展[3-10]，并且HearNPV已經(jīng)被成功地商業(yè)化，作為生物農(nóng)藥得到了廣泛的應(yīng)用[11]。但目前關(guān)于HearNPV對(duì)棉鈴蟲(chóng)的侵染病理學(xué)的研究相對(duì)較少，見(jiàn)諸報(bào)道的只有2篇文獻(xiàn)：張忠信等[12]于1998年報(bào)道了病毒感染對(duì)棉鈴蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育與生殖力的影響，之后于歡等[13]于2012年指出，HearNPV感染棉鈴蟲(chóng)后能夠下調(diào)堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá)水平。

眾所周知，病毒屬于嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生生物，不具備自身的能量、代謝、蛋白翻譯與酶系統(tǒng)，昆蟲(chóng)病毒作為一類重要的生物殺蟲(chóng)劑，其在侵染宿主昆蟲(chóng)過(guò)程中也會(huì)參與宿主的生理、生化代謝。桿狀病毒感染宿主昆蟲(chóng)過(guò)程中，除了上述對(duì)宿主昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育、ALP活性產(chǎn)生影響外，尚不明確其是否還對(duì)宿主昆蟲(chóng)其他代謝途徑和重要酶類存在影響。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase,GST)是生物體內(nèi)重要的解毒酶系之一，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，也是昆蟲(chóng)防御功能相關(guān)的重要水解酶。昆蟲(chóng)GST基因?qū)r(nóng)藥代謝解毒和內(nèi)源物質(zhì)代謝具有重要作用，GST的變化是昆蟲(chóng)對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性的途徑之一[14]。除ALP之外，HearNPV感染棉鈴蟲(chóng)后是否對(duì)宿主中腸GST產(chǎn)生影響尚未見(jiàn)研究報(bào)道。為此，本研究通過(guò)GST活性的測(cè)定及相關(guān)基因表達(dá)的分析，研究病毒感染對(duì)宿主中腸GST的調(diào)控作用，旨在深入理解HearNPV對(duì)棉鈴蟲(chóng)侵染的病理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試蟲(chóng)與病毒

棉鈴蟲(chóng)(H.armigera)1齡幼蟲(chóng)來(lái)源于中科白云生物技術(shù)有限公司(北京)，于自然光照、23～25 ℃室溫條件下人工飼料飼養(yǎng)。飼養(yǎng)至2齡幼蟲(chóng)蛻皮后，挑選大小均勻的試蟲(chóng)饑餓過(guò)夜，于第2天用于生物測(cè)定。

棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒 C1株，由浙江大學(xué)張傳溪教授饋贈(zèng)，并由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院分子病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)繁保存。

1.2 病毒感染處理

將3齡健康試蟲(chóng)900只隨機(jī)分為3組：1組為對(duì)照(CK)，無(wú)病毒感染；其余2組均為病毒感染處理組，染毒量分別為50和100 PIB/只。每組300只，每個(gè)重復(fù)100只，共3個(gè)重復(fù)。試蟲(chóng)感染病毒約5 d后死亡率顯著上升，因此本試驗(yàn)測(cè)定時(shí)間段選在4 d以內(nèi)，以確保測(cè)定階段多數(shù)試蟲(chóng)存活。對(duì)照和感染病毒組試蟲(chóng)在感染后6，12，24，48，72，96 h 時(shí)，分別隨機(jī)取試蟲(chóng)40只，每10只為1個(gè)樣本，用于測(cè)定GST活性(3個(gè)重復(fù)，共30只)和制備總RNA(1個(gè)重復(fù)，但后續(xù)RT-PCR測(cè)定3次)。

1.3 GST活性的測(cè)定

采用Booth等[15]的方法測(cè)定GST活性。將1.2節(jié)感染后不同時(shí)間選取的30頭活蟲(chóng)隨機(jī)分為3個(gè)重復(fù)(10只為1個(gè)重復(fù))，在冰盤(pán)上解剖出中腸(去掉圍食膜)放入玻璃勻漿器中，加入一定量事先放入冰箱中預(yù)冷的內(nèi)含10 mmol/L還原型谷胱甘肽的Tris-HCl緩沖液(pH8.9)，在冰浴上充分勻漿后，4 ℃下10 000×g離心15 min，取上清液作為粗酶液。 準(zhǔn)備2組干凈的具塞試管，分別加入提取的酶液0.1 mL，再加入1.4 mL Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L pH8.9)，在25 ℃下水浴10 min，立刻加入60 μL 30 mmol/L 2，4-二硝基氯苯，在紫外分光光度計(jì)上比色測(cè)定3 min內(nèi)酶活性(OD340 nm)的變化量。測(cè)定3次取平均值，最后計(jì)算3個(gè)重復(fù)的平均值。

1.4 GST基因的RT-PCR分析

取1.2節(jié)感染后不同時(shí)間的10頭活蟲(chóng)中腸，立即加液氮研磨，用Trizol試劑(購(gòu)自TaKaRa公司)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取試蟲(chóng)總RNA。將總RNA溶于50 μL DEPC處理的雙蒸水中，加DNaseⅠ(購(gòu)自TaKaRa公司)消化除去基因組DNA，存于-80 ℃冰箱待用。用PrimeScriptTMRT reagent試劑盒(購(gòu)自TaKaRa公司)制備cDNA(20 μL體系)，依次加入6 μL RNase Free H2O、4 μL 5×PrimeScript Buffer、0.5 μL oligo dT引物、0.5 μL隨機(jī)引物、10 μL RNA，最后加入1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶，充分混勻后，37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃處理5 s，制得cDNA，于-20 ℃冰箱保存。

參考GenBank中的GST序列(AY058242)設(shè)計(jì)qPCR引物GST2-F(5′-GTTTGGACTGGGTGGAGACAAT-3′)和GST2-R(5′-CCTCTGCAAGAGTTCTGGGTAA-3′)；以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，參考GenBank中已知的GAPDH序列( JF417983.1)設(shè)計(jì)qPCR引物GFAPDH-F(5′-AGAGGGTGGTGCTAAGAAGGTCA-3′)和GFAPDH-R(5′-CCAGAGGAGCGAGGCAGTTGGTT-3′)；用SYBR Premix ExTaqⅡ(Perfect Real Time)(購(gòu)自TaKaRa公司)試劑盒，按廠商提供的操作步驟進(jìn)行RT-PCR。每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCT法[16]。數(shù)據(jù)分析時(shí)，采用SPSS Statistics 17.0求均值、標(biāo)準(zhǔn)誤，用LSD法進(jìn)行多重比較。GST活性和表達(dá)量數(shù)據(jù)通過(guò)Graphpad Prism 5繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉鈴蟲(chóng)感染HearNPV對(duì)GST活性的影響

由圖1可見(jiàn)，棉鈴蟲(chóng)感染其病原病毒HearNPV后，在50和100 PIB/只的感染劑量下，其中腸GST活性均呈先升高后下降的趨勢(shì)。感染后6 h時(shí)，感染組和對(duì)照(非感染組)之間均無(wú)顯著差異；直至感染后12 h時(shí)，被感染試蟲(chóng)的GST活性與對(duì)照相比均顯著升高(P<0.05)，但50和100 PIB/只感染劑量處理間并無(wú)顯著差異；感染后24 h時(shí)，與對(duì)照相比，2種感染劑量被感染試蟲(chóng)的GST活性均極顯著升高(P<0.01)；在感染后48 h時(shí)，無(wú)論感染劑量高低，被感染試蟲(chóng)的GST活性與對(duì)照相比均無(wú)顯著差異；至感染后72 h時(shí)，高低2種感染劑量出現(xiàn)不同的變化，低感染劑量組(50 PIB/只)試蟲(chóng)的GST活性與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，而高感染劑量組(100 PIB/只)試蟲(chóng)的GST活性與對(duì)照相比顯著下降；感染96 h時(shí)，與對(duì)照相比高低2種感染劑量處理試蟲(chóng)的GST活性均極顯著降低(P<0.01)。以上數(shù)據(jù)顯示：棉鈴蟲(chóng)在受其病原病毒感染后，感染初期其GST活性呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，但隨感染時(shí)間的推移GST活性被顯著抑制。

圖1 感染HearNPV后不同時(shí)間棉鈴蟲(chóng)GST活性的變化*表示差異顯著(P<0. 05)，**表示差異極顯著(P<0.01)， 以下同

2.2 棉鈴蟲(chóng)感染HearNPV對(duì)GST表達(dá)水平的影響

由圖2可見(jiàn)，HearNPV感染棉鈴蟲(chóng)后6 h，在50 PIB/只的低感染劑量下，棉鈴蟲(chóng)中腸GST表達(dá)水平與對(duì)照相比略有增高，但差異并不明顯；而高劑量(100 PIB/只)感染后，GST表達(dá)水平與對(duì)照相比顯著增高(P<0.05)。感染后12 h，無(wú)論感染劑量高低，病毒感染試蟲(chóng)的GST表達(dá)水平與對(duì)照相比均極顯著增高(P<0.01)。持續(xù)到感染后24 h，高劑量感染組試蟲(chóng)的GST表達(dá)水平與對(duì)照相比顯著增高(P<0.05)，而低劑量感染試蟲(chóng)的GST表達(dá)水平與對(duì)照相比仍為極顯著增高(P<0.01)。至感染后48 h，低劑量感染組試蟲(chóng)的GST表達(dá)水平與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，但高劑量感染組試蟲(chóng)的GST表達(dá)水平較對(duì)照顯著降低(P<0.05)。持續(xù)感染72 h以后，無(wú)論感染劑量高低，病毒感染試蟲(chóng)的GST表達(dá)水平與對(duì)照相比均極顯著降低(P<0.01)。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明，病毒感染能夠調(diào)控宿主昆蟲(chóng)的GST表達(dá)水平，感染初期表現(xiàn)為上調(diào)作用，但隨著病毒感染時(shí)間的推移，宿主昆蟲(chóng)的GST表達(dá)水平顯著下調(diào)。

圖2 感染HearNPV后不同時(shí)間棉鈴蟲(chóng)GST基因相對(duì)表達(dá)量的變化

綜合酶活性和基因表達(dá)水平的的變化來(lái)看，病毒感染宿主昆蟲(chóng)后，GST活性首先被激活，并呈現(xiàn)出顯著升高趨勢(shì)，伴隨GST活性的升高，其編碼基因的表達(dá)水平也呈上調(diào)趨勢(shì)。隨病毒感染時(shí)間的延長(zhǎng)，GST活性最終顯著降低，而GST基因轉(zhuǎn)錄水平也被顯著抑制。無(wú)論病毒感染劑量高低，GST活性及其編碼基因表達(dá)水平的變化趨勢(shì)表現(xiàn)一致，即GST活性在病毒感染過(guò)程中先被激活后被抑制，其編碼基因表達(dá)水平也具有相同的變化趨勢(shì)。

3 結(jié)論與討論

本研究中HearNPV病毒感染其宿主昆蟲(chóng)棉鈴蟲(chóng)后，感染初期宿主昆蟲(chóng)中腸的GST活性顯著升高，但從感染后48 h開(kāi)始，GST活性被逐漸抑制直至極顯著低于未感染的病毒對(duì)照?；虮磉_(dá)分析表明，病毒感染對(duì)GST編碼基因表達(dá)水平的影響與其對(duì)GST活性的影響表現(xiàn)一致。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)是昆蟲(chóng)體內(nèi)的一類與抗性有關(guān)的初級(jí)代謝及次級(jí)代謝酶系。谷胱甘肽(GSH)廣泛分布于昆蟲(chóng)的各種細(xì)胞中，參與細(xì)胞運(yùn)輸、保護(hù)作用以及許多外源化合物有關(guān)的代謝，反應(yīng)涉及的關(guān)鍵酶是GST。GST能使有害的親電物質(zhì)與內(nèi)源的還原型谷胱甘肽 (GSH)結(jié)合，參與轉(zhuǎn)運(yùn)體內(nèi)重要的脂類化合物，能為谷胱甘肽的S原子提供電子催化親核反應(yīng)。親電性底物包括內(nèi)源性物質(zhì) (如環(huán)氧化物、過(guò)氧化物、氧化代謝產(chǎn)生的有活性的直鏈烯類)及外源性物質(zhì) (如殺蟲(chóng)劑等有毒物質(zhì))，在親電物質(zhì)與GSH結(jié)合后將其排出體外，保護(hù)體內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸等[17]。昆蟲(chóng)病毒作為其宿主的病原微生物，在侵染過(guò)程中會(huì)參與宿的主機(jī)體代謝、誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生一些不利于病毒侵染與增殖的代謝產(chǎn)物，以增強(qiáng)宿主對(duì)病原微生物的抵御作用，削弱病毒的侵染能力，而這些物質(zhì)同樣也對(duì)宿主有害，這可能是病毒感染初期誘導(dǎo)GST基因表達(dá)量升高的原因之一[14]，而后期宿主昆蟲(chóng)GST的下調(diào)作用則可能與病毒感染造成蟲(chóng)體衰弱、細(xì)胞代謝紊亂有關(guān)，這與于歡等[13]的研究結(jié)果類似。是否還有其他的調(diào)控機(jī)制，如何更深一步了解昆蟲(chóng)病原微生物與宿主昆蟲(chóng)的互作應(yīng)答機(jī)制，都有待進(jìn)一步深入研究。

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Effect ofHelicoverpaarmigeranucleopolyhedrovirus infection on GST activity andGSTexpression on host insect

HUANG Shi-di,HUANG Cai-ping,YU Huan,WANG Dun

(StateKeyLaboratoryofCropStressBiologyforAridAreas,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 The effect ofHelicoverpaarmigeranucleopolyhedrovirus (HearNPV) infection on enzyme activity and gene expression of Glutathione S-transferase (GST) of host insect was studied to understand the role of virus in regulating host GST after infection. 【Method】 The GST enzyme activity and gene expression of 3 years oldH.armigerainfected with virus at doses of 50 and 100 PIB per insect were determined at different times.Then the viral infection groups and control group were compared to reveal the differences in enzyme activity and gene expression of GST.【Result】 GST activity and its gene expression level were up-regulated significantly at the beginning of HearNPV infection.Over time,both were down-regulated,indicating that effect on GST activity by viral infection was related to its expression level.【Conclusion】 The viral invasion to host cell triggeredGSTexpression and increased enzyme activity at the beginning.ButGSTexpression was inhibited by persistent infection over time.

Helicoverpaarmigeranucleopolyhedrovirus (HearNPV);GST;GSTgene;expression level

時(shí)間:2015-10-13 08:46

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.11.019

2014-03-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31270691,31170609)

黃詩(shī)迪(1987-)，女，河北廊坊人，在讀碩士，主要從事昆蟲(chóng)病毒分子生物學(xué)研究。E-mail:huangshidi2008@163.com

王 敦(1973-)，男，青海西寧人，教授，博士，主要從事昆蟲(chóng)生化與分子生物學(xué)、昆蟲(chóng)病毒分子生物學(xué)與生物防治研究。E-mail:wanghande@nwsuaf.edu.cn

S476.13

A

1671-9387(2015)11-0129-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151013.0846.038.html