Ⅶ型NDV對(duì)鴿子和雞的致病性差異研究

楊少華，許傳田，胡北俠，張 琳，黃慶華，張秀美

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所 山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100)

Ⅶ型NDV對(duì)鴿子和雞的致病性差異研究

楊少華，許傳田，胡北俠，張 琳，黃慶華，張秀美

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所 山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100)

【目的】 研究NDV強(qiáng)毒(基因Ⅶ型)對(duì)鴿子和SPF雞的致病性差異?！痉椒ā?將試驗(yàn)鴿和SPF雞隨機(jī)分為4組，每組10只，給其中2組分別滴鼻和肌肉注射鴨源NDV分離株Duck/China/SD03/2009，攻毒劑量為106.2EID50，設(shè)空白對(duì)照組和同居感染組。攻毒后觀察臨床癥狀和剖檢變化，并對(duì)攻毒后3,5,7，14 d動(dòng)物的血清抗體，喉頭、泄殖腔的排毒情況及內(nèi)臟器官的病毒滴度、抗體效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)?！窘Y(jié)果】 鴿子感染NDV強(qiáng)毒后呼吸道癥狀不明顯，但腦膜嚴(yán)重出血，腺胃和腸道輕度出血，死亡率為10%～30%；而同期SPF雞攻毒后表現(xiàn)為急性感染癥狀，死亡率為100%。鴿子在攻毒后第7天均檢出排毒，至14 d時(shí)均未檢出。攻毒后5～14 d在所檢鴿體內(nèi)臟器官中均檢出病毒，以腦、肺、腸中的病毒含量較高。病毒也可誘導(dǎo)鴿子產(chǎn)生較高水平的血清抗體，至14 d時(shí)血清抗體HI滴度為512～2 048?！窘Y(jié)論】 基因Ⅶ型新城疫強(qiáng)毒株Duck/China/SD03/2009對(duì)鴿子和雞的致病性差異明顯，與SPF雞相比，鴿子感染后呼吸道和消化道癥狀較輕，死亡率也較低，表明基因Ⅶ型NDV強(qiáng)毒株能感染鴿子，但對(duì)鴿子的致病性較低。

鴿；SPF雞；新城疫病毒；致病性

新城疫(Newcastle disease,ND)是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的病毒性傳染病，病原是新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)。NDV又稱為禽副粘病毒1型(Avian paramyxovirus type 1,APMV-1)，屬于副粘病毒科副粘病毒亞科腮腺炎病毒屬[1]，其基因組為一條單股負(fù)鏈RNA，長(zhǎng)約15 kb，從3′到5′包含6個(gè)開(kāi)放性閱讀框，依次編碼核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)和大分子蛋白(L)6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(3′-NP-P-M-F-HN-L-5′)[1]。NDV宿主范圍非常廣泛，不但能感染家禽，而且可以感染水禽和多種鳥(niǎo)類[2-3]。鴿副粘病毒1型(Pigeon paramyxovirus type 1,PPMV-1) 起源于20世紀(jì)70年代后期中東地區(qū)[4]，隨后傳到歐洲以及其他國(guó)家和地區(qū)，我國(guó)多數(shù)地區(qū)也有該病的報(bào)道[3,5-7]。分子流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，從發(fā)病鴿群中分離的NDV均為基因Ⅵ型[2-5,7],而目前危害我國(guó)家禽的NDV強(qiáng)毒為基因Ⅶ型[2,8-9]。為了更好地理解NDV對(duì)不同宿主的致病性，本研究選取1株鴨源NDV強(qiáng)毒分離株在鴿子和雞上進(jìn)行了致病性差異評(píng)價(jià)，旨在為ND的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病 毒 新城疫病毒分離株Duck/China/SD03/2009是從山東發(fā)病鴨群中分離的，其最小致死雞胚平均死亡時(shí)間(MDT)和1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)(ICPI)分別為52 h和1.87，屬于基因Ⅶ型NDV強(qiáng)毒株。病毒的雞胚半數(shù)感染量為10-8.2EID50/0.1 mL。

1.1.2 SPF雞胚、SPF雞和試驗(yàn)鴿 10日齡SPF雞胚和30日齡SPF雞，購(gòu)自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所SPF雞研究中心；35日齡健康非免疫肉鴿購(gòu)自某個(gè)體養(yǎng)殖戶。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)分組 將40只試驗(yàn)肉鴿隨機(jī)分成4組(A1、A2、A3和A4)，每組10只；將40只30日齡SPF雞隨機(jī)分成4組(B1、B2、B3和B4)，每組10只。A1、A2組鴿與B1、B2組雞分別以滴鼻和肌肉注射2種途徑攻毒Duck/China/SD03/2009，攻毒劑量均為每只106.2EID50；A3和B3組為同居感染對(duì)照，分別與A1、A2和B1、B2組動(dòng)物飼養(yǎng)在同一隔離器內(nèi)；A4和B4為空白對(duì)照組，分別肌肉注射0.1 mL無(wú)菌生理鹽水。攻毒后每天觀察并記錄各組試驗(yàn)雞和鴿的精神、采食、糞便及發(fā)病死亡情況。

1.2.2 樣品的采集與檢測(cè) 攻毒后第3，5，7和14天,每組隨機(jī)取5只試驗(yàn)動(dòng)物采集喉頭、泄殖腔棉拭子，處理后接種10日齡SPF雞胚，檢測(cè)其排毒情況； 對(duì)攻毒后第5，7，14天死亡的鴿子剖檢，取心、腦、肺、肝、腎、腺胃、腸等內(nèi)臟器官，研缽中研磨后以PBS依次作10倍稀釋，進(jìn)行雞胚尿囊腔接種，每個(gè)稀釋度接種8枚10日齡SPF雞胚，置37 ℃孵化48 h，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，收獲24 h后死亡雞胚和48 h存活雞胚的尿囊液，進(jìn)行HA效價(jià)的測(cè)定，Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度；攻毒后第7和14天每組取5只鴿子，翅靜脈采血約1 mL/只，分離血清，通過(guò)血凝抑制試驗(yàn)(HI)檢測(cè)NDV 抗體效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NDV強(qiáng)毒攻毒后試驗(yàn)鴿和雞的臨床癥狀及病理變化

觀察發(fā)現(xiàn)，A1和A2 2個(gè)攻毒組試驗(yàn)鴿第3天采食量下降，第5天部分鴿子開(kāi)始表現(xiàn)出翅膀下垂、癱瘓、流淚等臨床癥狀，呼吸道癥狀不明顯。A2組鴿子排綠色稀糞嚴(yán)重，攻毒后5 d出現(xiàn)死亡。在14 d觀察期內(nèi)，A1、A2和A3組鴿病死率分別為20%，30%和10%(表1)，病死鴿主要表現(xiàn)腦膜嚴(yán)重出血、腺胃和腸道輕度出血?？瞻讓?duì)照組(A4組)試驗(yàn)鴿精神、食欲正常。

B1、B2和B3各組試驗(yàn)雞在攻毒后3 d開(kāi)始出現(xiàn)死亡，至第5天全部死亡；B4空白對(duì)照組試驗(yàn)雞觀察期內(nèi)精神、食欲正常(表1)。

2.2 NDV強(qiáng)毒攻毒后試驗(yàn)鴿和雞喉頭、泄殖腔的病毒檢測(cè)結(jié)果

攻毒后鴿子喉頭、泄殖腔排毒結(jié)果顯示， 3個(gè)試驗(yàn)組鴿子在攻毒后第7天均檢出排毒，至14 d時(shí)均未檢出。A2肌肉注射組試驗(yàn)鴿攻毒后第3，5，7和14天喉頭或泄殖腔棉拭子中NDV的總體檢出率均低于A1滴鼻組。B1～B3組試驗(yàn)雞攻毒后至5 d時(shí)全部死亡，只檢測(cè)到3 d的病毒排毒情況?？瞻讓?duì)照組試驗(yàn)鴿(A4)和試驗(yàn)雞(B4)的病毒檢測(cè)均為陰性(表2)。

表1 NDV強(qiáng)毒攻毒后試驗(yàn)鴿和SPF雞的死亡率Table 1 Mortality of experimental pigeons and SPF chickens infected with virulent NDV

表2 NDV強(qiáng)毒攻毒后不同時(shí)間試驗(yàn)鴿和SPF雞喉頭、泄殖腔中NDV的檢出率(n=5)Table 2 NDV detection rate of throat and cloaca of experiment pigeons and SPF chickens at different times post infection with virulent NDV strain(n=5) %

注：*“-”表示未進(jìn)行該項(xiàng)試驗(yàn)。

Note:“-” represents not conducted.

2.3 NDV強(qiáng)毒攻毒后試驗(yàn)鴿內(nèi)臟器官的病毒滴度

在NDV攻毒后5，7，14 d剖檢試驗(yàn)鴿心、腦、肺、肝、腎、腺胃和腸，檢測(cè)病毒滴度，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可知，在攻毒后5～14 d所檢測(cè)各臟器均檢出NDV，以腦、肺、腸的病毒含量較高，這與臨床剖檢結(jié)果基本一致。心、肝、腦的NDV滴度在攻毒后5 d達(dá)最高值，之后呈逐漸下降的趨勢(shì)。肺、腎、腺胃、腸的NDV滴度在攻毒后第7 天達(dá)到最高，之后逐漸下降。

圖1 NDV強(qiáng)毒攻毒后不同時(shí)間鴿子內(nèi)臟器官的病毒滴度
Fig.1 Virus titles of pigeons organs at different times post infection with virulent NDV

2.4 NDV強(qiáng)毒攻毒后試驗(yàn)鴿NDV抗體檢測(cè)結(jié)果

由于試驗(yàn)雞于攻毒后5 d全部死亡，因此B1～B4組沒(méi)有進(jìn)行此項(xiàng)檢驗(yàn)。由表3可知，攻毒后7 d，A1、A2、A3組鴿子HI抗體效價(jià)為8～32，至14 d時(shí)試驗(yàn)組鴿子NDV抗體均上升到較高水平，效價(jià)達(dá)512以上，而同期對(duì)照組鴿子NDV抗體為0。

表3 試驗(yàn)鴿攻毒后NDV HI抗體效價(jià)Table 3 Antibody titers of pigeons in hemagglutination inhibition (HI) test

3 討 論

Duck/China/SD03/2009是從發(fā)病鴨群中分離的基因Ⅶ型NDV強(qiáng)毒株，對(duì)雞有很強(qiáng)的致病性，攻毒5 d后試驗(yàn)雞全部死亡；而以相同的劑量經(jīng)滴鼻或肌肉注射途徑攻毒鴿，鴿子出現(xiàn)與自然感染相似的臨床癥狀，臨床癥狀較輕，表明Duck/China/SD03/2009對(duì)鴿子和雞的致病性差異明顯。

本研究中鴿子感染基因Ⅶ型NDV的死亡率為30%，而已有研究發(fā)現(xiàn)，基因Ⅵ型NDV感染試驗(yàn)鴿最高可導(dǎo)致100%的病死率[7,10]，由此可見(jiàn)，基因Ⅶ型與基因Ⅵ型NDV的致病性具有一定的宿主特異性，其原因有待于進(jìn)一步研究。排毒檢測(cè)結(jié)果表明，各試驗(yàn)組鴿的排毒期均為7 d；滴鼻組鴿子攻毒后病毒檢測(cè)陽(yáng)性率均高于肌肉注射組，推測(cè)經(jīng)過(guò)呼吸道途徑進(jìn)入試驗(yàn)鴿體內(nèi)的病毒量可能高于肌肉注射組。攻毒后3 d各組試驗(yàn)雞喉頭泄殖腔棉拭子均檢測(cè)出排毒，且檢出率明顯高于試驗(yàn)鴿。對(duì)鴿子內(nèi)臟器官進(jìn)行病毒滴定結(jié)果顯示，攻毒后第5天時(shí)腦的病毒含量最高，其次是肺、腺胃、腎、腸、肝、心，表明Duck/China/SD03/2009能在這些組織中較好地增殖，雖然攻毒后14 d產(chǎn)生了較高水平的血清抗體，在一定程度上降低了發(fā)病率和死亡率，但仍然無(wú)法抑制病毒在體內(nèi)的增殖和排毒。新城疫病毒只有一個(gè)血清型，不同毒株新城疫病毒的毒力有很大的差異。研究顯示，鴿子對(duì)基因Ⅵ型NDV比較敏感，從發(fā)病鴿群分離到的NDV均為基因Ⅵ型[3,5,11-12]?；颌鲂蚇DV也可以傳染給雞，引起雞群新城疫的發(fā)生[13-14]，并在雞新城疫的流行上起著一定的作用[5,11,15]。許如蘇[16]報(bào)道用鴿子進(jìn)行速發(fā)型NDV傳代，第2代即不再發(fā)病，第3代即不能從臟器中分離到病毒，因此認(rèn)為鴿子對(duì)速發(fā)型NDV自然感染具有抵抗力。本研究中，雖然基因Ⅶ型強(qiáng)毒NDV分離株Duck/China/SD03/2009對(duì)鴿子致病性不強(qiáng)，但鴿群均可被感染，且可通過(guò)喉頭和泄殖腔向體外排毒，并可使同居鴿群感染發(fā)病死亡。因此，有必要采取有效措施做好鴿群NDV的防控，切斷NDV在鴿群和雞群之間的相互傳播，這對(duì)于家禽NDV的有效防控具有重要意義。

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Differences in pathogenicity of genotype Ⅶ Newcastle disease virus to pigeons and chickens

YANG Shao-hua,XU Chuan-tian,HU Bei-xia,ZHANG Lin,HUANG Qing-hua,ZHANG Xiu-mei

(ShandongKeyLabofAnimalDiseaseControlandBreeding,InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShandongAcademyofAgriculturalSciences，Jinan,Shandong250100,China)

【Objective】 This study aimed to compare the pathogenicity of genotype Ⅶ NDV to pigeon and chickens. 【Method】 Forty pigeons and forty SPF chickens were divided randomly into four groups,respectively,with 10 in each group.Two groups were infected with NDV strain Duck/China/SD03/2009 with the dose of 106.2EID50.The other groups were blank control group and cohabitation infection group.Clinical signs and gross lesions were observed.Serum antibody virus shedding and virus titer in organs at different times after infection were also detected.【Result】 Respiratory symptoms of pigeons inoculated with Duck/China/SD03/2009 strain were not obvious.Dead pigeons were mainly manifested by meningeal hemorrhage,glandular stomach and intestinal mild bleeding with mortality rate of 10%-30%.Chickens experimentally infected characterized by acute symptoms and the mortality rate was 100%.Virus shedding of three pigeon groups was detected at 7 d post infection,but was not detected at 14 d.Virus was detected in organs of dead pigeons at 5,7,and 14 d post infection,and brain,lung and intestine had higher virus titers than other organs.The virus also induced infected pigeons to generate higher HI serum antibody titers of 512-2 048 at 14 d post infection.【Conclusion】 The pathogenicity of virulent NDVs of genotype Ⅶ strain Duck/China/SD03/2009 to the pigeons and SPF chicken was significantly different.Compared with SPF chickens,infected pigeons manifested lighter respiratory and gastrointestinal symptoms and had a lower mortality rate.It is indicated that the genotype Ⅶ NDV can infect pigeons,but the pathogenicity is low.

pigeon;SPF chicken;Newcastle disease virus;pathogenicity

時(shí)間:2015-10-13 08:46

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.11.007

2014-04-03

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201003012，201303033)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-42-Z12)

楊少華(1978-)，女，山東煙臺(tái)人，助理研究員，碩士，主要從事禽病綜合防控技術(shù)研究。E-mail:ysh7865@163.com

張秀美(1956-)，女，江蘇徐州人，研究員，主要從事禽病綜合防控技術(shù)研究。E-mail:zxm820410@163.com

S855.3

A

1671-9387(2015)11-0041-04

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151013.0846.014.html