地鱉蟲提取物對大鼠運動能力和骨骼肌抗氧化酶活性的影響

高穎暉，周萬紅，馬 賀，戚一曼，王 敦

(西北農林科技大學 a 應用昆蟲學重點實驗室，b 體育部，陜西 楊凌 712100)

地鱉蟲提取物對大鼠運動能力和骨骼肌抗氧化酶活性的影響

高穎暉a,b，周萬紅b，馬 賀a，戚一曼a，王 敦a

(西北農林科技大學 a 應用昆蟲學重點實驗室，b 體育部，陜西 楊凌 712100)

【目的】 探討補充地鱉蟲提取物對大鼠運動能力、骨骼肌抗氧化酶表達水平及活性的影響，以明確其作為運動補劑的可能性。【方法】 對大負荷游泳訓練大鼠按各組平均體質量的0.5,1.0和1.5 g/kg劑量分別補充地鱉蟲提取物，在8周大負荷訓練結束后測定大鼠力竭游泳時間、骨骼肌抗氧化酶活性及其原因表達水平。【結果】 8周大負荷訓練后，與單純大負荷運動組相比，補充地鱉蟲提取物組大鼠運動能力顯著提高，其骨骼肌SOD、CAT、GST 3種抗氧化酶活性均顯著增加，同時3種抗氧化酶編碼基因的表達水平也顯著上調?！窘Y論】 補充地鱉蟲提取物能夠顯著提高大鼠運動能力和骨骼肌抗氧化酶活性，其可能的機理是地鱉蟲提取物上調了抗氧化酶編碼基因的表達水平。

地鱉蟲提取物；運動大鼠；運動能力；骨骼肌抗氧化酶；表達水平；酶活性

地鱉蟲(Eupolyphagasinensis)，又名土元、蟅蟲、土鱉等，是常用的昆蟲源中藥材，其生藥為蜚蠊目鱉蠊科昆蟲地鱉蟲的雌蟲干燥蟲體。目前該蟲已完全實現(xiàn)了人工養(yǎng)殖。地鱉蟲的藥用記載最早見《神農本草經》，描述其具有“主心腹寒熱洗洗，血積癥瘕，破堅，下血閉”等作用[1]。在《本草綱目》中也有“行產后血積、折傷瘀血、小兒腹痛夜啼”等醫(yī)效記載[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，地鱉蟲具有促進動物骨骼再生、抗凝、調節(jié)血脂、抗脂質過氧化等作用；臨床研究也有類似發(fā)現(xiàn)；特別是其能夠提高人體含硒谷胱甘肽過氧化酶(GSH)和谷胱甘肽過氧化酶(GSH-PX)活性[3-5]。除藥用外，地鱉蟲還被開發(fā)為功能性食品，例如肴“油煎銀鱉”、地鱉蟲氨基酸口服液等[6]，說明地鱉蟲具有開發(fā)為功能食品或補劑的潛力。本研究在分析地鱉蟲浸膏的動物抗氧化作用基礎上，探索該浸膏抗氧化酶編碼基因表達水平的體外調控機理，旨在明確其作為運動補劑的可能性，為深入利用藥用昆蟲資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物 試驗動物為雄性SD大鼠共50只，平均體質量240 g/只，購自西安交通大學醫(yī)學院醫(yī)學試驗動物中心。大鼠被隨機分為5組進行室內飼養(yǎng)：通風、自然光照、22～24 ℃，自由飲水進食、大鼠標準混合飼料喂養(yǎng)。

1.1.2 昆蟲材料及其浸膏制備 地鱉蟲(Eupolyphagasinensis)，購自西安中藥材公司。將購回的地鱉蟲放于60 ℃干燥箱中干燥8 h，充分干燥后粉碎、過20目篩(孔徑900 μm)，均勻混和后密封保存。上述粉碎的地鱉蟲材料用常溫常壓冷浸法[7-8]提取，萃取液旋蒸獲得浸膏(以下簡稱為EEES)。浸膏溶解于分析純乙醇溶液中，配制成質量濃度為1.0 g/mL的溶液，2 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 方 法

1.2.1 訓練方法 5組大鼠適應性喂養(yǎng)1周，剔除生長不良和體質量偏差較大的個體，重新隨機分為4組(每組10只)，按照任啟俊等[7]的運動方案進行訓練。對照組(CK)灌服5%乙醇水溶液10 mL，其他試驗組在每次訓練后按各組平均體質量0.5，1.0和1.5 g/kg分別灌服地鱉蟲提取物。于第8 周訓練最后一天，各組小鼠進行力竭游泳，力竭運動開始試驗時按大鼠體質量的8%為負重負荷，以大鼠沉入水中10 s不能浮出水面為力竭標準。

1.2.2 樣品處理 大鼠最后一次運動訓練結束后頸椎脫臼處死，立即切取其大腿部位骨骼肌，用冰浴預冷的生理鹽水沖洗1次，濾紙吸除骨骼肌表面水分，加入液氮、冰浴研磨，每組肌肉樣品取3 g用于RNA制備(每個處理3個重復、每個重復1 g樣品)，其余樣品用生理鹽水制成100 g/L勻漿液，4 000 r/min 、4 ℃離心10 min后將上清液轉移入滅菌離心管中,置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酶活性的測定 過氧化氫酶(CAT) 、超氧化物歧化酶(SOD) 、谷胱甘肽轉移酶(GST)活性測定均采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)完成。

1.2.4 RT-PCR分析 取1.2.2節(jié)制備的各組肌肉樣品，分別用Trizol提取總RNA后，立即采用試劑盒RT reagent Kit Perfect Real Time (TaKaRa)進行反轉錄獲得cDNA，cDNA用于后續(xù)檢測。3種抗氧化酶的RT-PCR檢測采用20 μL體系：其中SYBR Premix ExTaqⅡ反應液10 μL，引物各0.8 μL，模板DNA 2.0 μL，雙蒸水6.4 μL。RT-PCR反應條件：階段Ⅰ為95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；階段Ⅱ為95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)；階段Ⅲ為65 ℃ 15 s。檢測儀器為iCycler iQ5 RT-PCR儀 (Bio-Rad)。3個基因檢測引物序列如下。

β-actin-F：GAAATTGTGCGCGACATCAAGGA；

β-actin-R：GCAATGCCCGGGTACATGGTGGT；

CAT-F：ACAAGGCAATCCAGTCTATT；

CAT-R：AATCGTCCAACAGGTATCAA；

GST-F：GGGCATCTGAAACCTTTTGA；

GST-R：GAGCCACATAGGCAGAGAGC；

SOD-F：GCCTTGACTCTCCTGTAC；

SOD-R：GCTCGTCCTATTATAGAATGTG。

表達量分析采用目的基因與內參基因(β-actin)表達量的倍數比值表示。

1.3 數據分析

分析用試驗數據均為3次重復的平均值，采用SPSS(12.0)軟件對試驗數據進行單因素t檢驗,顯著性水平設置為α=0.05的顯著和α=0.01的極顯著。采用EXCEL制表，采用GraphPad Prism 5制圖。

2 結果與分析

2.1 地鱉蟲提取物對運動訓練大鼠運動能力的影響

表1顯示,與單純大負荷運動組(CK)力竭運動時間相比，補充地鱉蟲提取物均能顯著延長大鼠大負荷運動時間,且該時間的增加與提取物添加水平呈正相關。

表1 地鱉蟲提取物對大鼠力竭游泳時間的影響Table 1 Effects of EEES on exhaustive swimming time of exercised rats

注：*同列數據后標不同小寫字母表示差異顯著，標不同大寫字母表示差異極顯著。下表同。

Note:Different lowercase letters in each column mean significant difference compared to CK (α=0.05),and different capital letters mean very significant difference compared to CK (α=0.01).The same below.

2.2 地鱉蟲提取物對運動訓練大鼠肌肉抗氧化酶活性的影響

由表2可知，與單純大負荷運動組(CK)相比，在地鱉蟲提取物0.5 g/kg的添加水平，大負荷運動補充地鱉蟲提取物試驗組SOD、CAT和GST活性顯著升高；當地鱉蟲提取物在1.0 g/kg的添加水平以上時，SOD、CAT和GST活性均極顯著升高。表明大負荷運動大鼠補充地鱉蟲提取物后，其肌肉抗氧化酶活性均有顯著提高，并存在顯著的劑量相關性。

2.3 地鱉蟲提取物對運動訓練大鼠骨骼肌抗氧化酶基因表達水平的影響

由圖1可知，與單純大負荷運動組(CK)相比，地鱉蟲提取物0.5 g/kg的添加水平時，補充地鱉蟲提取物試驗組SOD表達水平顯著升高；當地鱉蟲提取物在1.0 g/kg的添加水平以上時，SOD表達水平極顯著升高。該結果說明大運動訓練的試驗動物在補充地鱉蟲提取物后，其SOD基因表達水平顯著提高，且與地鱉蟲提取物的添加劑量呈正相關。與單純大負荷運動組(CK)相比，補充地鱉蟲提取物在0.5 g/kg添加水平時，CAT表達水平略微升高，差異不顯著；當地鱉蟲提取物的補充水平增加至1.0 g/kg以上時，CAT表達水平極顯著升高。與單純大負荷運動組(CK)比較，補充地鱉蟲提取物試驗組在0.5 g/kg添加水平時，GST表達水平顯著升高，并持續(xù)到補充劑量達到1.0 g/kg時，當地鱉蟲提取物的添加水平增加至1.5 g/kg時，GST的表達水平極顯著升高。說明地鱉蟲對于運動大鼠GST表達水平的上調作用與其補充劑量呈正相關。

表2 地鱉蟲提取物對大鼠抗氧化酶活性的影響Table 2 Effects of EEES on antioxidant enzyme activities of exercised rats

圖1 地鱉蟲提取物對大鼠骨骼肌3種抗氧化酶基因表達水平的影響*表示差異顯著(α=0.05)，**表示差異極顯著(α=0.01)

3 討 論

關于地鱉蟲的藥理作用研究發(fā)現(xiàn)，地鱉蟲提取物的抗凝作用與其纖溶活性蛋白組分相關[9]，而這類纖溶活性蛋白被證明具有一定的抗癌活性[10-12]。另外，也有研究報道地鱉蟲粗提物具有顯著的抗氧化作用[13]。本研究進一步采用動物試驗證明了地鱉蟲的抗氧化作用，并且其抗氧化作用與其對試驗動物抗氧化酶編碼基因的上調存在相關性。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)補充地鱉蟲提取物能夠顯著提高運動大鼠的運動能力，推測這種促進作用可能與抗氧化酶對大負荷運動產生過氧化物的清除作用有關。動物在劇烈運動的情況下引起體內自由基大幅增加，從而能夠引起肌細胞傷害并影響運動能力[14]。因此，國內外許多研究都采用天然自由基拮抗物質作為抗氧化功能增進劑或運動恢復補劑[15-19]。本研究發(fā)現(xiàn)地鱉蟲提取物不僅能夠明顯延長大鼠游泳力竭時間、提高抗氧化酶活性，而且能夠提高3種抗氧化酶編碼基因的表達水平。因此推測其可能的機理之一是，地鱉蟲提取物上調了運動大鼠肌肉中抗氧化酶編碼基因的表達水平，從而顯著提高試驗動物骨骼肌SOD、CAT、GST的活性，達到有效對抗肌肉細胞內的過氧化反應和延緩運動疲勞發(fā)生的作用。

4 結 論

大負荷運動訓練大鼠補充一定量地鱉蟲提取物后，其運動能力顯著提高，骨骼肌中3種抗氧化酶活性均顯著升高，同時3種抗氧化酶的編碼基因表達水平也有顯著升高。說明地鱉蟲提取物對運動大鼠運動能力的提高與其抗氧化功能相關，這種促進作用可能的機理之一是，地鱉蟲提取物上調了這些抗氧化酶編碼基因的表達水平。

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《植物遺傳資源學報》征訂啟事

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報道內容為大田、園藝作物，觀賞、藥用植物，林用植物、草類植物及其一切經濟植物的有關植物遺傳資源基礎理論研究、應用研究方面的研究成果、創(chuàng)新性學術論文和高水平綜述或評論。諸如，種質資源的考察、收集、保存、評價、利用、創(chuàng)新，信息學、管理學等；起源、演化、分類等系統(tǒng)學；基因發(fā)掘、鑒定、克隆、基因文庫建立、遺傳多樣性研究。

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Effects of ethanol extract fromEupolyphagasinensison sports performance and activities of antioxidant enzymes in skeletal muscle of rats

GAO Ying-huia,b,ZHOU Wan-hongb,MA Hea,QI Yi-mana,WANG Duna

(aKeyLabofAppliedEntomology,bDepartmentofPE,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 The effects of ethanol extract fromEupolyphagasinensis(EEES) on sports performance and activities and expression levels of antioxidant enzymes in skeletal muscle of exercised rats were analyzed to investigate the possibility of using it as sports supplement.【Method】 The EEES was supplemented to exercised rats at three dose levels of 0.5,1.0 and 1.5 g/kg.The exhaustive swimming time,and activities and encoded genes expression levels of antioxidant enzymes in skeletal muscle were measured after eight weeks training.【Result】 The exhaustive swimming time of rats supplemented with EEES increased significantly compared to non-supplemented training rats (α=0.05).The activities of SOD,CAT and GST of EEES supplemented rats were increased significantly compared to non-supplemented training rats.Meanwhile,the expression levels of encoded genes of the three enzymes were up-regulated as well.【Conclusion】 The exercise performance and antioxidant enzymes activities in skeletal muscle were improved by EEAC supplementation,which is possibly due to the improvement of encoded gene expression levels by EEAC supplementationinvivo.

ethanol extract ofEupolyphagasinensis;exercised rat;exercise performance;antioxidant enzymes in skeletal muscle;expression level;enzyme activity

時間:2015-10-13 08:46

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.11.004

2015-04-24

國家自然科學基金項目(30500391)

高穎暉(1973-)，女，陜西西安人，講師，碩士,主要從事運動生理生化研究。E-mail:yinghuigao@aliyun.com

王 敦(1973-)，男，青海西寧人，教授，博士，主要從事生化與分子生物學研究。E-mail:wanghande@nwsuaf.edu.cn

G804.7

A

1671-9387(2015)11-0024-05

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151013.0846.008.html