響應(yīng)面法優(yōu)化CTF619—D菌株液體發(fā)酵工藝研究

康敬芹+呂躍東+陶琳+王勇+劉楊+張良

摘要：為了提高CTF619-D發(fā)酵液中的代謝物質(zhì)濃度，獲得更多有效抗菌活性成分，采用響應(yīng)面法對菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，CTF619-D菌株的最佳發(fā)酵條件為搖床轉(zhuǎn)速119.33 r/min、裝液量109.75 mL、溫度26.78 ℃。

關(guān)鍵詞：放線菌;發(fā)酵;優(yōu)化;響應(yīng)面分析

中圖分類號(hào)：TS201.3 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）12-2867-04

Liquid Fermentation Process Optimization for CTF619-D by Response Surface Method

KANG Jing-qin1， LV Yue-dong， TAO Lin2， WANG Yong1， LIU Yang1， ZHANG Liang1

（1.Liaoning University of Science and Technology， Anshan 114051，Liaoning，China;2.Shenyang Normal University， Shenyang 110034，China）

Abstract： In order to improve the concentration of metabolites in CTF619-D fermentation broth for more effective antimicrobial active ingredient the liquid fermentation conditions for CTF619-D were optimized by response surface method. The ?optimum fermentation conditions were： shaking speed of 119.33 r/min， liquid volume of 109.75 mL， and temperature of 26.78 ℃. The inhibition zone diameter was up to 27.58 mm under optimized conditions.

Key words： actinomycetes; fermentation; optimization; response surface analysis

放線菌是具有巨大使用價(jià)值的一類微生物，是抗生素的主要生產(chǎn)菌，是新醫(yī)藥、新農(nóng)藥和生物防治活菌劑研制的源頭[1]。目前，已知的抗生素大約有80%來自于放線菌，其產(chǎn)生的抗生素具有抗腫瘤、抗真菌、抗細(xì)菌、抗寄生蟲等多種活性[2]。在植物病害生物防治中，拮抗微生物主要是鏈霉菌屬及其相關(guān)類群[3]。據(jù)報(bào)道，淡紫灰鏈霉菌是一類重要的抗生素產(chǎn)生菌， 其產(chǎn)生的醫(yī)用抗生素如薰衣草菌素、鏈絲菌素和農(nóng)用抗生素如中生菌素等都已有廣泛的用途[4]。目前，國內(nèi)關(guān)于拮抗淡紫灰鏈霉菌鑒定的諸多研究中，除淡紫灰鏈霉菌海南變種外，未見有其他淡紫灰鏈霉菌變種的報(bào)道。因此，CTF619-D是一株有價(jià)值的具生物活性的生防菌株，期待進(jìn)一步開發(fā)其在瓜果蔬菜病害防治領(lǐng)域中的應(yīng)用。本試驗(yàn)以菌株CTF619-D為發(fā)酵菌種，用響應(yīng)面法對菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化[5]，以實(shí)現(xiàn)試驗(yàn)次數(shù)的最小化和多因素交互作用分析，并建立變量與響應(yīng)量之間的模型，預(yù)測最優(yōu)的條件和結(jié)果，從而獲得該菌代謝產(chǎn)生有效抗菌活性成分的最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)，為該菌株在工業(yè)上大量生產(chǎn)代謝物質(zhì)提供一定的實(shí)踐基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?菌株 ?供試菌株為放線菌菌株CTF619-D（由遼寧科技大學(xué)生物試驗(yàn)室分離、篩選并保存）;指示菌株為番茄炭疽菌、黃瓜炭疽菌、蘋果腐爛菌等植物病原菌，由遼寧科技大學(xué)生物制藥工藝室提供。

1.1.2 ?儀器 ?HZQ-C型空氣浴振蕩器（哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠）、SPX-250B-G型光照培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、TGL-16C型高速離心機(jī)（無錫市瑞江分析儀器有限公司）;ZHWY-2102型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海向帆儀器有限公司）、ES-315型高壓滅菌鍋（杭州科曉化工儀器設(shè)備有限公司）、T-203型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、SW-CJ-5型超凈工作臺(tái)（南京庚辰科學(xué)儀器公司）等。

1.2 ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ?菌株的活化和發(fā)酵培養(yǎng) ?將保存的放線菌菌株CTF619-D接種于高氏1號(hào)固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，進(jìn)行活化。然后將菌種接種至裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于28℃、140 r/min培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)。

1.2.2 ?抑菌活性物質(zhì)的測定 ?將菌株CTF619-D接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，經(jīng)不同的發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)后，將菌液于4 000 r/min條件下無菌離心10 min。然后把無菌濾紙片在離心所得的上清液中浸泡3 min后置于接種農(nóng)業(yè)致病真菌的PDA平板中央，于25℃條件下恒溫培養(yǎng)72h后，再分別測量抑菌圈直徑，每個(gè)試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)，取平均值。確定最佳發(fā)酵條件。

1.2.3 ?響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵試驗(yàn)

1）Placket-Burman（P-B）設(shè)計(jì)試驗(yàn)[6]。首先采用單因素試驗(yàn)依次對淀粉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、種子菌齡、接種量、裝液量、發(fā)酵時(shí)間、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、pH等11個(gè)液體發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。每個(gè)試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)，取平均值。然后對植物病原菌進(jìn)行抑制試驗(yàn)。確定抑菌圈最大的單因素發(fā)酵培養(yǎng)條件。然后在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取N=11的P-B試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，將影響微生物發(fā)酵11個(gè)因素作為P-B設(shè)計(jì)的主要成分。根據(jù)單因素對高水平（1）和低水平（-1）進(jìn)行設(shè)定，一般高水平設(shè)定為低水平的1.25～1.50倍，抑菌圈直徑作為響應(yīng)值y。P-B設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平見表1。數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，分別對數(shù)據(jù)作單因子方差分析，以P<0.05表示差異性顯著。選出影響抑菌圈大小的3個(gè)顯著因子。endprint

2）Box-Behnken（B-B）試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)及P-B試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對整個(gè)發(fā)酵模型影響最大的3個(gè)顯著因子進(jìn)行響應(yīng)面分析，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行B-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)因素3個(gè)水平，中心點(diǎn)有5個(gè)重復(fù)。響應(yīng)面分析試驗(yàn)以顯著因素為自變量，以抑菌圈直徑為響應(yīng)值，來確定各因素對植物病原菌影響。

1.2.4 ?模型的驗(yàn)證試驗(yàn) ?為了進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測值，利用優(yōu)化后確定的培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)，取平均值。所得數(shù)值與預(yù)測值進(jìn)行比較，來確定采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的發(fā)酵條件是否準(zhǔn)確可靠，是否具有實(shí)用價(jià)值。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?Placket-Burman試驗(yàn)結(jié)果分析

按照Placket-Burman試驗(yàn)的設(shè)計(jì)方法來考察各個(gè)因素對響應(yīng)值抑菌圈直徑的影響。P-B試驗(yàn)結(jié)果見表2。表中數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理（見表3），在這個(gè)模型中X7、X9、X10 3項(xiàng)的P值較其他項(xiàng)小，為模型的顯著項(xiàng)。篩選出影響發(fā)酵培養(yǎng)的3個(gè)顯著因子依次為裝液量、溫度、搖床轉(zhuǎn)速。其P值均小于0.05。說明這個(gè)回歸模型是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。由表3回歸模型方差分析表可知，回歸分析的決定系數(shù)R2=1.000，說明自變量和因變量形成的散點(diǎn)與回歸曲線高度接近，即散點(diǎn)基本都集中于回歸線上。說明這個(gè)回歸模型是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。

2.2 ?顯著影響因子的Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果分析

由表5可知，20組試驗(yàn)中除3個(gè)顯著因素外，其他因素取值與初始培養(yǎng)條件中取值一致。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)的培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并對植物病原菌進(jìn)行抑菌活性測定。每組重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，得到相應(yīng)的抑菌圈直徑填入表中。利用Design-Expert8.0.6軟件對表5結(jié)果進(jìn)行處理，確定回歸方程為Y=27.22-0.59A-1.27B-1.01C+0.38AB-0.37AC+0.38BC-1.98A2-1.98B2-2.51C2。該回歸方程的方差分析結(jié)果見表6。其中模型P<0.000 1，失擬P=0.104 1>0.05。說明該模型回歸顯著而失擬不顯著。另外，通過可信度分析可看知，精簡模型校正后的復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方為0.945 5，說明精簡模型能解釋響應(yīng)值變化的94.55%，進(jìn)一步證明試驗(yàn)方程式與實(shí)際數(shù)據(jù)之間具有非常好的擬合性。預(yù)測值和實(shí)際值之間具有高度的相關(guān)性。另外調(diào)整后的復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.896 4，說明89.64%數(shù)據(jù)的可變性可用此模型來解釋，即響應(yīng)值的變化有89.64%取決于裝液量、溫度、搖床轉(zhuǎn)速3個(gè)顯著因子的取值，因此可以用該方法對其結(jié)果進(jìn)行預(yù)測和分析，離散系數(shù)（Coeflcient of variation，CV）表示試驗(yàn)精確度。其值越大，試驗(yàn)的可靠性就越低。此模型中CV為4.88%，說明試驗(yàn)操作可信，模型選擇正確。所以，可確定此回歸方程準(zhǔn)確、可靠。同時(shí)得出當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為119.33 r/min，裝液量為109.75 mL，溫度為26.78 ℃，理論抑菌圈最大直徑為27.58 mm。

響應(yīng)曲面圖是回歸方程的圖形表述，通過響應(yīng)面和等高線圖可以直觀、有效地找到最佳參數(shù)和各參數(shù)之間的相互作用及最大響應(yīng)值。由以上回歸方程，通過Design-Expert軟件作出抑菌圈直徑對裝液量、溫度、搖床轉(zhuǎn)速的響應(yīng)曲面圖，最大響應(yīng)值由等高線上最小橢圓所示（圖1～圖3）。通過計(jì)算回歸方程的值可知，響應(yīng)面圖所示最大響應(yīng)值和各因素參數(shù)值與計(jì)算的值一致。

2.3 ?模型的驗(yàn)證

為了檢驗(yàn)響應(yīng)面分析法的可靠性，采用上述優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，實(shí)際測得抑菌圈的直徑為27mm，與預(yù)測值的相對誤差為2.11%（表7）。采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的培養(yǎng)條件工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 ?結(jié)論

P-B設(shè)計(jì)法是近年來國際上普遍采用的試驗(yàn) 設(shè)計(jì)方法[7-9]，它能快速、有效地從眾多因子中篩選出影響抑菌活性最為重要的幾個(gè)因素供進(jìn)一步研究。響應(yīng)面法（RSM）是一種優(yōu)化過程的綜合技術(shù)，可同時(shí)對影響生物過程的因子水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評價(jià)[10]。因此它可快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件[11，12]。與傳統(tǒng)優(yōu)化方法相比，RSM所需的試驗(yàn)組數(shù)相對較少，優(yōu)化方法更為有效，因此基于這種統(tǒng)計(jì)方法的試驗(yàn)設(shè)計(jì)廣泛地應(yīng)用于生化微生物工程等方面[13-16]。本試驗(yàn)利用Design-Expert 8.0.6軟件對CTF619-D菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，建立多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，并利用SAS對模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。優(yōu)化得到最佳發(fā)酵條件為： 淀粉17.5 g/L，硝酸鉀1.1 g/L，磷酸氫二鉀0.4 g/L，硫酸亞鐵0.001 g/L，種子菌齡72 h，接種量17 mL，發(fā)酵時(shí)間6.5 d，pH 7.5，搖床轉(zhuǎn)速為119.33 r/min，裝液量為109.75 mL，溫度為26.78 ℃。在此優(yōu)化條件下，抑菌圈直徑直徑為27.58 mm，較優(yōu)化前的抑菌圈直徑（16 mm）提高了72%，為菌株CTF619-D的發(fā)酵培養(yǎng)提供了理論試驗(yàn)數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步研究CTF619-D菌株及工業(yè)化液體發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。

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