利用RNA干擾技術(shù)研究長牡蠣TLR2—2基因?qū)yD88—2基因表達(dá)的影響

李穎翔+杜以帥+張琳琳+李莉+張國范

摘要：為研究長牡蠣（Crassostrea gigas）免疫基因TLR2-2對MyD88-2基因表達(dá)的調(diào)控作用，將體外合成的dsRNA注射進入成體長牡蠣體內(nèi)，72 h后檢測TLR2-2基因和MyD88-2基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，成功地對TLR2-2基因和MyD88-2基因進行了干擾，而在TLR2-2基因被干擾后，MyD88-2基因的表達(dá)量顯著下降，但在MyD88基因被干擾的長牡蠣中TLR2-2基因表達(dá)量沒有明顯變化。

關(guān)鍵詞：RNA干擾;長牡蠣（Crassostrea gigas）;TLR2-2基因;MyD88-2基因

中圖分類號：Q786 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：0349-8114（2014）12-2860-04

Effects of Inhibition of TLR2-2 Gene by RNA Interference on MyD88-2 Gene in Crassostrea gigas

LI Ying-xiang1，2，DU Yi-shuai1，ZHANG Lin-lin1，LI Li1，ZHANG Guo-fan1

（1.Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences， Qingdao 266071，Shandong，China;

2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100039，China）

Abstract：Double strands RNA synthesized in vitro transcription was injected to adult Pacific oysters（Crassostrea gigas）， to study the interaction between TLR2-2 and its potential downstream MyD88 gene. The expression of TLR2-2 and MyD88-2 analyzed by qPCR reduced 72 h after injection. Moreover， in oysters where expression of TLR2-2 was inhibited by dsRNA， MyD88-2 was also found down-regulated， while the expression level of TLR2-2 in oysters where MyD88-2 was suppressed was not significant different compared with that of control group.

Key words： RNA interference; Crassostrea gigas; TLR2-2 gene; MyD88-2 gene

由于技術(shù)手段的限制，經(jīng)典的基因功能研究方法（如誘變）在軟體動物中暫時無法得到應(yīng)用，而RNA干擾技術(shù)則成為了軟體動物基因沉默的反向遺傳學(xué)研究工具[1]。利用雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默也是一種應(yīng)用非常普遍的技術(shù)手段。在細(xì)胞中，dsRNA可以被Dicer酶切割成約21～23 bp的雙鏈RNA片段，即siRNA（small interference RNA），siRNA整合到沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex， RISC），引導(dǎo)復(fù)合體中的酶切割目標(biāo)基因的mRNA，從而達(dá)到使目標(biāo)基因沉默[2-5];在脊椎動物中，dsRNA已經(jīng)被證明可以特異性地抑制目標(biāo)基因的表達(dá);而在軟體動物中，尤其是雙殼貝類，雖然已經(jīng)有研究在日本珍珠貝、櫛孔扇貝等物種中利用dsRNA成功實現(xiàn)目標(biāo)基因沉默[6-8]，但整體上，在雙殼貝類中RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用還遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于脊椎動物。

Toll-like receptor（TLR）家族參與的信號通路是天然免疫系統(tǒng)中非常重要的通路，其中TLR家族能夠作為模式識別受體（Pattern recognition receptor，PRRs）參與入侵微生物或病原體的識別并激活免疫反應(yīng)。研究表明，MyD88（Myeloid differentiation factor 88）可以通過其TIR結(jié)構(gòu)域參與到該信號通路來闡明TLR信號通路。本研究通過在長牡蠣中對TLR2-2基因和MyD88-2基因進行dsRNA干擾，研究了長牡蠣天然免疫中TLR2-2基因與MyD88-2基因的上下游調(diào)控關(guān)系，為長牡蠣天然免疫的深入研究提供了參考，也為RNA干擾技術(shù)在雙殼貝類的應(yīng)用提供了借鑒。

1 ? 材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?試驗材料 ?長牡蠣取自山東省青島市膠南海域，選擇大小一致、健康的個體，試驗前于海水培養(yǎng)箱中暫養(yǎng)1周，每天換水。

1.1.2 ?主要試劑 ?Trizol購自Invitrogen公司;PrimeScript RT Reagent Kit With gDNA Eraser和SYBR Premix Ex Taq酶購自寶生物工程（大連）有限公司;氨芐青霉素、卡那霉素、LB培養(yǎng)基、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司;Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit、Transcript Aid T7 High Yield Transcription Kit購自Fermentas公司，其他試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。endprint

1.1.3 ?主要儀器 ? 7500 Fast型熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司），高速冷凍離心機、Nanodrop 2000超微量分光光度計（ThermoFisher公司），普通PCR儀（BIOER公司），冰箱、超低溫冰箱、微量可調(diào)移液器、恒溫?fù)u床、高壓鍋、制冰機、水浴鍋和超凈工作臺等。

1.2 ?方法

1.2.1 ?引物的設(shè)計 ?PCR所用的引物根據(jù)GenBank中長牡蠣TLR2-2基因（OYG_10012212）和MyD88-2基因（Accession No. KC155822.1）序列設(shè)計，EF-1α（Elongation Factor-1α）基因為內(nèi)參基因，具體序列見表1。

1.2.2 ?dsRNA的制備 ? 剖取大小一致、健康的長牡蠣鰓組織，以Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA。以cDNA為模版，用5′端帶T7啟動子的引物進行擴增，PCR擴增片段連接pMD 19-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑取菌落進行PCR，選取陽性克隆對應(yīng)的剩余菌液擴大培養(yǎng)并測序。根據(jù)測序結(jié)果，提取的質(zhì)粒即為雙鏈RNA體外轉(zhuǎn)錄的模版。體外轉(zhuǎn)錄模版，利用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑盒提供步驟進行操作，即可獲取dsRNA。

將獲得的dsRNA以瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度;用Nanodrop 2 000超微量分光光度計測量濃度和RNA純度;同時用RNase A和DNase I兩種酶檢測產(chǎn)物的質(zhì)量。用RNase A和DNase I進行檢測時，按照試劑說明書，將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別與RNase A以1∶1的比例，與DNase I以1∶4的比例一起在37 ℃孵育30 min，孵育后電泳檢測。

1.2.3 ?dsRNA的注射及取樣 ? 將體外轉(zhuǎn)錄合成的dsRNA溶解于滅菌的PBS緩沖液中，使其終濃度為1 μg/μL。從暫養(yǎng)1周后的長牡蠣中選取健康個體48只，隨機分為4組，分別標(biāo)記為空白對照組、PBS對照組、TLR干擾組和MyD88干擾組，每組單獨置于一個養(yǎng)殖桶中。TLR干擾組和MyD88干擾組每只分別注射100 μL其對應(yīng)的dsRNA，PBS對照組每只注射100 μL的PBS緩沖液，空白對照組不做處理。注射后72 h進行血細(xì)胞樣品的取樣，提取總RNA，用于檢測目的基因表達(dá)量。

1.2.4 ?目的基因表達(dá)量的檢測 ? 基因表達(dá)量的檢測通過實時熒光定量PCR進行。以Trizol法提取總RNA，以Nanodrop 2000超微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和純度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模版，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL，PCR擴增程序為95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。以Elongation Factor-1α（EF-1α）基因為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? dsRNA的制備與檢測

以Nanodrop 2000超微量分光光度計檢測合成的dsRNA的純度，發(fā)現(xiàn)A260 nm/280 nm為1.9，產(chǎn)量為120 μg/個轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（20 μL）。同時瓊脂糖凝膠進行電泳檢測發(fā)現(xiàn)dsRNA的條帶單一，且片段大小與模版cDNA大小相符（圖1、圖2）。對于合成的dsRNA的檢測，主要采用了RNase A和DNase I兩種酶進行。將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與RNase A以1∶1的比例在37 ℃孵育30 min，電泳檢測發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物完全降解，而將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與DNase I以1∶4的比例在37 ℃孵育30 min，則發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物未被降解（圖3）。檢測結(jié)果說明轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是RNA，而不是DNA。

2.2 ?dsRNA干擾的效果檢測

dsRNA注射72 h后，提取血細(xì)胞檢測目的基因相對表達(dá)量（相對內(nèi)參基因EF-1α的表達(dá)量）。與空白對照組、PBS對照組相比，TLR組（圖4A）和MyD88 組（圖4B）注射的dsRNA均有效地降低了目的基因的相對表達(dá)量，其中TLR組TLR2-2基因表達(dá)量較PBS組下降了76.7%，而MyD88組MyD88-2基因相對表達(dá)量也是較PBS組下降了74.3%，而PBS組與空白對照組中，兩個目的基因的相對表達(dá)量沒有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.3 ? TLR2-2基因干擾后對下游MyD88-2基因影響的檢測

由圖5可以看出，與PBS對照組相比，TLR干擾組中MyD88-2基因的相對表達(dá)量大幅下降;與PBS對照組相比，MyD88干擾組中TLR2-2基因的相對表達(dá)量差異不大。

3 ?小結(jié)與討論

RNAi作為反向遺傳學(xué)的工具已經(jīng)成為研究基因功能的有效手段。近年來，這項技術(shù)在無脊椎動物的研究中也開始得到了越來越廣泛的應(yīng)用。但在長牡蠣等雙殼貝類中相關(guān)的技術(shù)較脊椎動物還是非常不成熟的。研究認(rèn)為，dsRNA處理后靶標(biāo)mRNA水平下降70%以上，才可以認(rèn)為干擾有效[15]。雖然也有其他研究質(zhì)疑這一標(biāo)準(zhǔn)過于苛刻，認(rèn)為mRNA表達(dá)量不必下降到這個水平才可引起足夠的蛋白表達(dá)量變化和表型差異[16]，但即使按照70%的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，本研究干擾效果也可以被認(rèn)為是有效的。

目前，對長牡蠣中天然免疫系統(tǒng)的研究還是非常少，貝類和無脊椎動物缺少特異性的免疫反應(yīng)和免疫記憶，所以完全依賴細(xì)胞和體液介導(dǎo)的天然免疫來進行病原防御。本研究初步探究了長牡蠣中TLR2-2基因沉默后對MyD88-2基因的影響，為其調(diào)控關(guān)系的確定提供了研究支持，對于明確TLR和MyD88在天然免疫系統(tǒng)中的作用提供了幫助。

參考文獻(xiàn)：endprint

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