Sphingomonas sp.生產(chǎn)威蘭膠分批發(fā)酵動力學(xué)

許曉鵬， 鄭志永， 朱 莉， 詹曉北*

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝及技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

Sphingomonas sp.生產(chǎn)威蘭膠分批發(fā)酵動力學(xué)

許曉鵬1，2， 鄭志永1， 朱 莉1， 詹曉北*1，2

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝及技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

為了優(yōu)化革蘭氏陰性棒狀桿菌（Sphingomonas sp.）生產(chǎn)的發(fā)酵過程，對該菌發(fā)酵生產(chǎn)威蘭膠分批發(fā)酵動力學(xué)進(jìn)行了研究，利用數(shù)學(xué)建模方法得到了描述該菌株在7 L發(fā)酵罐中菌體生長、威蘭膠合成和氮源消耗動力學(xué)數(shù)學(xué)模型。實(shí)驗(yàn)和模型數(shù)據(jù)的比較結(jié)果證明，該模型計(jì)算值與實(shí)際結(jié)果擬合良好，為其應(yīng)用在威蘭膠的放大工業(yè)化生產(chǎn)提供了依據(jù)。

威蘭膠；革蘭氏陰性棒狀桿菌；發(fā)酵動力學(xué)；數(shù)學(xué)模擬

威蘭膠 （welan gum）是革蘭氏陰性棒狀桿菌（Sphingomonas sp.）發(fā)酵生產(chǎn)的一種微生物胞外多糖，威蘭膠的結(jié)構(gòu)骨架由D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖單元組成。在葡萄糖及鼠李糖相連的葡萄糖殘基的C3位上連接有α-L-鼠李糖或α-L-甘露糖支鏈[1]，連接鼠李糖的幾率占2/3；此外，約有半數(shù)的四糖片段上帶有乙酰基及甘油基團(tuán)[2-3]。威蘭膠中含有2.8%～7.5%乙?；?，11.6%～14.9%的葡萄糖醛酸，甘露糖、葡萄糖和鼠李糖的摩爾比例為1∶2∶2[4]，結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 威蘭膠的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of welan gum

威蘭膠具有優(yōu)良的觸變性、懸浮性、水溶性等流變性能，且具有卓越的穩(wěn)定性，市場前景廣闊。它主要作為增稠劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、潤滑劑、成膜劑和粘合劑應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)的各個(gè)方面，尤其在混凝土、石油、石墨等工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用前景。

威蘭膠是美國的CP Kelco公司20世紀(jì)80年代繼黃原膠、結(jié)冷膠之后開發(fā)的最具市場前景的微生物代謝多糖之一。目前CP Kelco公司已成為威蘭膠全球惟一的生產(chǎn)和供應(yīng)商，國內(nèi)在這方面研究較少[5-8]。作者對Sphingomonas sp.ZJ01進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，采用matlab編程軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得出數(shù)學(xué)模擬公式，以便對以后的實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)提供幫助。

研究發(fā)酵動力學(xué)是實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程最優(yōu)控制的前提條件，也是研究發(fā)酵過程放大及從分批發(fā)酵過渡到流加發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵的理論基礎(chǔ)。動力學(xué)模型的建立，離不開模型參數(shù)的估算。目前常見數(shù)學(xué)模型的參數(shù)擬合方法有線性轉(zhuǎn)化法、非線性擬合法和遺傳算法。線性轉(zhuǎn)化法比較簡單，不需要高深的數(shù)學(xué)知識，但由于違背了某些統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)律，往往擬合誤差較大。非線性擬合法能直接擬合，但當(dāng)動力學(xué)方程存在多個(gè)局部極值的情況下容易陷入局部最優(yōu)，擬合值讓人不放心。而遺傳算法具有多點(diǎn)尋優(yōu)、并行處理等特點(diǎn)，搜索過程是從初始解群開始，以適應(yīng)函數(shù)作為尋優(yōu)判據(jù)，適者生存，劣者淘汰，直接對解群進(jìn)行操作，不依賴模型的具體表達(dá)式，因此，它搜索面廣，尋優(yōu)效率高，能以較大概率逼近全局最優(yōu)解。代志凱[9]比較了線性轉(zhuǎn)化擬合、非線性擬合和遺傳算法擬合法三種方法的擬合效果，結(jié)果表明：線性轉(zhuǎn)化法擬合誤差較大，非線性和遺傳算法擬合效果較好，但遺傳算法能以較大概率逼近全局最優(yōu)，而非線性擬合法則容易陷入局部最優(yōu)。因此作者采用遺傳算法對菌體生長動力學(xué)進(jìn)行擬合。

發(fā)酵動力學(xué)是對微生物生長和產(chǎn)物形成過程的定量描述，它研究微生物生長、發(fā)酵產(chǎn)物合成、底物消耗之間的動態(tài)定量關(guān)系，確定微生物生長速率、發(fā)酵產(chǎn)物合成速率、底物消耗速率及其轉(zhuǎn)化率等發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)特征，以及各種理化因子對這些動力學(xué)參數(shù)的影響，并建立相應(yīng)的發(fā)酵動力學(xué)過程的數(shù)學(xué)模型，從而達(dá)到認(rèn)識發(fā)酵過程規(guī)律及優(yōu)化發(fā)酵工藝，提高發(fā)膠產(chǎn)量和效率的目的。

在微生物發(fā)酵過程中，發(fā)酵動力學(xué)是發(fā)酵過程優(yōu)化和控制的重要基礎(chǔ)，通過發(fā)酵動力學(xué)的研究，有助于深入了解微生物代謝的規(guī)律，從而有利于建立合理的發(fā)酵工藝或?qū)σ延械陌l(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化[10]。Moser等按建模方式將其分為3類：機(jī)制模型、數(shù)學(xué)模型和正規(guī)模型。由于微生物反應(yīng)過程非常復(fù)雜，在發(fā)酵過程中建立機(jī)制模型幾乎不可能，所以目前國內(nèi)外學(xué)者所建模型大多為第2類和第3類，其中又以數(shù)學(xué)建模較為簡便，使用得最為廣泛[11]。

微生物分批發(fā)酵動力學(xué)主要研究微生物在分批發(fā)酵過程中生長動力學(xué)、基質(zhì)消耗動力學(xué)和代謝產(chǎn)物生成動力學(xué)。

威蘭膠發(fā)酵碳源為過量的底物，因此其對菌體的生長有底物限制作用，而隨著威蘭膠濃度的增加其對菌體生長亦有限制的作用，因此作者在Monod方程[10]μ=的基礎(chǔ)上，增加了底物抑制和產(chǎn)物抑制對菌體生長的影響，使方程更能反映菌體實(shí)際的生長過程。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器

Sphingomonas sp.ZJ01：江南大學(xué) 生化工程與生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)室自行保藏；蔗糖、葡萄糖、酵母粉、大豆蛋白胨、麥芽提取物、魚粉蛋白胨、NaNO3、KH2PO4、NaOH、MgSO4·7H2O：購自中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，酵母粉3，麥芽提取物3，魚粉蛋白胨5；pH 7.0，115℃滅菌20 min，固體培養(yǎng)基添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 40，大豆蛋白胨0.7，NaNO34，KH2PO40.6，MgSO4·7H2O 0.2；121℃滅菌20 min。

1.2.2發(fā)酵工藝取兩環(huán)經(jīng)活化的菌種，接種到500 mL的種子瓶中，裝液量為100 mL，30℃恒溫?fù)u床200 r/min培養(yǎng)24 h得到種子液，以接種體積分?jǐn)?shù)6%接種至7 L發(fā)酵罐 （Bio flo115發(fā)酵罐，美國New Brunswick公司），通氣量1 vvm，轉(zhuǎn)速與溶氧相關(guān)聯(lián)，控制溶氧不低于30%，發(fā)酵周期70 h，取樣間隔4 h，裝液量4 L，pH值控制在7.0。

1.2.3 發(fā)酵液中NaNO3濃度的測定采用酚二磺酸法測定[12-13]。取1 g發(fā)酵液加入4 g去離子水?；靹蚝笥?0 000 r/min離心20 min，取0.20 mL上清液，加入0.80 mL酚二磺酸溶液混勻后靜置30 min，加2 mol/L NaOH溶液定容至20 mL，410 nm波長測定吸光度。

1.2.4 發(fā)酵液中生物量的測定分別稱取發(fā)酵液3 g放入100 mL錐形瓶中，加濃鹽酸3.0 mL，室溫下（25℃左右）浸泡24 h，稀釋至HCl濃度為8.5 mol/mL，沸水浴 45 min進(jìn)一步消化，冷卻后用 1 mol/L NaOH溶液中和至pH 7，移入100 mL容量瓶，定容，過濾。準(zhǔn)確量取濾清液1.00 mL，加入1.00 mL蒸餾水，置10 mL具塞比色管中，加1.00 mL乙酰丙酮試劑，搖勻，沸水浴25 min，取出冷水至室溫，再加無水乙醇2.00 mL搖勻，加入對二甲氨基苯甲醛試劑1.00 mL，再以無水乙醇定容至10 mL，搖勻，于80℃水浴2 h，水冷至室溫，以空白溶液（不加試樣，其余步驟相同）為參比，測定525 nm波長處的吸光度。每個(gè)試樣平行測定3次，取3次平行測定的平均值[14]。

1.2.5 產(chǎn)膠率的測定定量稱取發(fā)酵液，三倍發(fā)酵體積的95%酒精沉淀，離心、用少量75%酒精清洗沉淀兩次，80℃烘至恒重，稱干膠質(zhì)量，干膠質(zhì)量與發(fā)酵液質(zhì)量的比即為產(chǎn)膠率。

1.2.6 發(fā)酵動力學(xué)模型本實(shí)驗(yàn)采用的動力學(xué)公式為：

式中：μ為微生物細(xì)胞生長速率；μm為微生物細(xì)胞最大生長速率；Ks是底物親和常數(shù)；S為底物濃度；X為微生物細(xì)胞濃度；Xm為最大微生物細(xì)胞濃度；P為代謝產(chǎn)物濃度；Pm為最大產(chǎn)物濃度；qs為限制性底物消耗速率；Y*x/s為底物轉(zhuǎn)化為微生物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率；qp為產(chǎn)物生成速率；α、β為常數(shù)。

根據(jù)產(chǎn)物形成與菌體生長的關(guān)系，將產(chǎn)物的形成分為三類：1）產(chǎn)物生產(chǎn)與菌體生長無關(guān)；2）產(chǎn)物生產(chǎn)與菌體生長部分偶聯(lián)；3）產(chǎn)物生產(chǎn)與菌體生長沒有關(guān)系。當(dāng)α=0，β≠0時(shí)產(chǎn)物行成與細(xì)胞生長無關(guān)；當(dāng)α≠0，β≠0時(shí)產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長部分偶聯(lián)；當(dāng)α≠0，β=0是產(chǎn)物形成于菌體生長相偶聯(lián)。

采用Matlab遺傳算法的程序進(jìn)行擬合，根據(jù)實(shí)驗(yàn)值擬合公式中的各參數(shù)的值，為之后的實(shí)驗(yàn)和工業(yè)化生產(chǎn)提供幫助。

遺傳算法（Genetic algorithms，GA）是一種基于生物自然選擇與遺傳機(jī)理的隨機(jī)搜索算法，以其高效、自適應(yīng)及益于全局搜索的優(yōu)勢在很多領(lǐng)域中得到應(yīng)用。它的搜索面廣，尋優(yōu)速度快，得到的結(jié)果能以較大概率接近全局最優(yōu)解。對于解決分批發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)，遺傳算法較傳統(tǒng)的方法具有不可比擬的優(yōu)勢[15-16]。

2 結(jié)果與討論

發(fā)酵實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1。

表1 發(fā)酵過程的參數(shù)值Table 1 Value of Sphingomonas sp.ZJ01 fermentation

發(fā)酵35 h后菌體濃度緩慢升高，主要是菌體到達(dá)穩(wěn)定期，另外隨著粘度的升高，系統(tǒng)的傳質(zhì)也受到了影響，因此也限制了菌體的生長。由圖2可以看出，在菌體濃度增長明顯趨緩時(shí)，產(chǎn)膠速率并沒有明顯的改變，主要是因?yàn)楫a(chǎn)膠是以一定菌體濃度為基礎(chǔ)的，葡萄糖在細(xì)胞內(nèi)部合成威蘭膠并排出細(xì)胞外，隨著粘度的增加，傳質(zhì)和傳氧都受到影響，產(chǎn)膠率也會達(dá)到穩(wěn)定值。圖2發(fā)酵液中殘氮下降速度也逐漸變慢，這和菌濃增長速度的變化相吻合，由圖2（實(shí)線為Matlab擬合的曲線，圓圈為實(shí)測的值）看出，Matlab擬合的公式很好的反映了威蘭膠發(fā)酵的菌濃變化，限制性底物氮源的變化和威蘭膠產(chǎn)物的變化過程。

通過反復(fù)擬合得出方程（1）、（2）、（3）三個(gè)方程的參數(shù)值分別為Ks、Xm、Pm、α、β。

圖2 Sphingomonas sp.ZJ01發(fā)酵動力學(xué)模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合Fig.2 Simulation of experimental data by kinetic model of Sphingomonas sp.ZJ01

由表2可以看出，Pm，Xm明顯比實(shí)際值大的多，說明隨著發(fā)酵的進(jìn)行，體系粘度越來越大，產(chǎn)膠速率和菌體增長速率會受到很大影響，從而在發(fā)酵后期產(chǎn)物的反饋抑制占據(jù)主導(dǎo)地位，因此菌體濃度和產(chǎn)膠率會比模擬值小很多。

表2 動力模型參數(shù)值估算值Table 2 Estimated value of kinetic model parameter

以上得到分批培養(yǎng)的模擬方程的方程組為：

3 結(jié)語

作者根據(jù)威蘭膠產(chǎn)生菌Sphingomonas sp.ZJ01的發(fā)酵特點(diǎn)，分別考慮到底物抑制、產(chǎn)物抑制、生物量抑制等方面對生物比生長速度的抑制，采用遺傳算法模擬出與實(shí)際發(fā)酵過程曲線擬合度較高的模擬曲線，說明最初選取的擬合公式體現(xiàn)了影響威蘭膠產(chǎn)生菌Sphingomonas sp.ZJ01發(fā)酵的主要因素，對后續(xù)策略性優(yōu)化調(diào)控威蘭膠的發(fā)酵具有一定的指導(dǎo)作用。

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Study on Welan Gum Fermentation Dynamics of Sphingomonas sp.

XU Xiaopeng1，2， ZHENG Zhiyong1， ZHU Li1， ZHAN Xiaobei*1，2
（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The EPS welan gum batch fermentation dynamics of Sphingomonas sp.were demonstrated.The mathematics models of the dynamic parameters of Sphingomonas sp.growth in 7 L fermentation reactor，synthesis of welan gum，and consumption of nitrogenous source were depicted. The estimated model parameters were confirmed bythe batchfermentation experiment data.These models offered the evidences for large scale production of welan gum.

welan gum，Sphingomonas sp.，fermentation dynamics，math model

TQ 920.1

A

1673—1689（2015）05—0507—05

2014-02-20

國家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD23B04）；國家863計(jì)劃項(xiàng)目（（2012AA021505）；無錫市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（CLE01N1208）。

許曉鵬（1978—），男，吉林白山人，發(fā)酵工程專業(yè)博士研究生，工程師，主要從事發(fā)酵工程及產(chǎn)物分離提取方面的研究。

E-mail：xuxiaopeng@jiangnan.edu.cn

*通信作者：詹曉北（1962—），男，北京人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事工業(yè)發(fā)酵與生物化工、糖生物技術(shù)方面的研究。

E-mail：xbzhan@yahoo.com