免疫磁球性能影響因素

杜美紅， 代鳳英， 許迪莘， 張 淼， 孫永軍， 左 嘉

（1.北京市理化分析測試中心，北京 100089；2.中國科學(xué)院過程工程研究所，北京 100190；3.北京市科學(xué)器材公司，北京100010）

免疫磁球性能影響因素

杜美紅1， 代鳳英2， 許迪莘3， 張 淼2， 孫永軍1， 左 嘉1

（1.北京市理化分析測試中心，北京 100089；2.中國科學(xué)院過程工程研究所，北京 100190；3.北京市科學(xué)器材公司，北京100010）

利用化學(xué)鍵法制備沙門氏菌捕獲富集用免疫磁球，通過平板培養(yǎng)計數(shù)法確定其對目標(biāo)菌的捕獲率，對影響免疫磁球性能的磁分離時間、目標(biāo)菌捕獲率、特異性及敏感性等主要因素進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，免疫磁球在不同的磁分離時間內(nèi)對目標(biāo)菌的捕獲率不同，在一定的的磁分離時間內(nèi)捕獲率達(dá)到最高；磁球與抗體的投料比影響免疫磁球的捕獲性能，磁球200 μg、抗體25 μg的投料制備的免疫磁球能獲得40%以上的捕獲效率，具有一定的靈敏性（100 cfu/mL的目標(biāo)菌捕獲率為50%以上）；免疫磁球的粒徑影響其捕獲性能，大粒徑（1 000 nm）免疫磁球目標(biāo)菌捕獲率小于小粒徑（180 nm）免疫磁球目標(biāo)菌捕獲率；免疫磁球?qū)卧隼钏固鼐⒔瘘S色葡萄球菌、志賀氏菌非特異性在10%以下，在一定程度上影響免疫磁球的特異性捕獲。

免疫磁球；捕獲率；磁分離時間；特異性；敏感性

免疫磁性微球是免疫學(xué)與磁性微球技術(shù)結(jié)合的一類新型材料，它是在磁性復(fù)合微球表面引入活性基團(tuán)，通過表面偶聯(lián)反應(yīng)或者吸附作用將抗體結(jié)合到微球上，形成免疫磁性微球。20世紀(jì)80年代，Ugelstad等人成功制成了第一批免疫磁性微球用于分離細(xì)胞并取得良好的效果[1]。此后，各國學(xué)者對免疫磁性微球的制備與應(yīng)用展開了大量研究，免疫磁性微球以其磁性和免疫特異性的特點(diǎn)，在細(xì)胞的分離純化、微生物富集與分離、蛋白質(zhì)分離和純化、核酸分離純化等方面迅速得到廣泛應(yīng)用[2-5]，從而引起了國內(nèi)外諸多公司及企業(yè)對免疫磁球系列產(chǎn)品的開發(fā)與研制。商用和科研用免疫磁球逐步市場化，對其性能的研究與評價成為必需。免疫磁球性能受磁響應(yīng)時間、目標(biāo)捕獲率、捕獲特異性、磁球穩(wěn)定性等多種因素影響。作者以抗沙門氏菌 （anti-Salmonella）免疫磁球為例，從免疫磁球的主要技術(shù)參數(shù)出發(fā)，探討對免疫磁球性能的影響，旨在為免疫磁球的應(yīng)用轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)，為免疫磁球的廣泛應(yīng)用提供有價值的參考及科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

AllMag PM3-2磁球：粒徑180 nm，上海奧潤微納 新 材 料 科 技 有 限 公 司 ；Dynabesds Myone Carboxyl：粒徑1 000 nm，北京思爾成生物技術(shù)有限公司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS）：北京百靈威科技有限公司；anti-Salmonella多克隆抗體：01-95-99，KPL，美國；磁力架：0.5T，Invitrogen公司；鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）（ATCC 14028）、單增李斯特菌 （ATCC 19115）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、志賀氏菌（ATCC 12022）、MH瓊脂、營養(yǎng)瓊脂：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；超高分辨率場發(fā)射掃描電鏡：德國MERLN；純水儀：美國Mili-Q MILLIPORE。

1.2 方法

1.2.1 免疫磁球制備分別取 200 μg AllMag PM3-2磁球、Dynabeads Myone Carboxyl磁球到離心管中，用無菌磷酸緩沖液（PBS）洗滌兩次，分別加入新配制的EDC和NHS溶液到離心管中，渦旋混勻，37℃活化30 min后移去多余的液體。加入25 μg anti-Salmonella多克隆抗體到離心管中，37℃偶聯(lián)3 h。移去多余液體，加1%BSA于37℃、30 min封閉免疫磁球。

1.2.2 磁分離時間考察將培養(yǎng)好的沙門氏菌液稀釋至約102cfu/mL，取1 mL菌液放入2 mL離心管中，分別加入相同一定量的anti-Salmonella免疫磁球，輕輕吹打均勻；在室溫下輕輕旋轉(zhuǎn)30 min；將離心管置于磁力架上，分別在5、10、15、20、30 min時小心取出離心管中全部液體 （上清液）；去磁場后，加1 mL PBS沖洗離心管壁上的菌體-免疫磁球，并均勻打散（下沉液）；將上清液與下沉液分別進(jìn)行適當(dāng)稀釋，營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)，37℃下經(jīng)過24～48 h后計數(shù)；同時將原沙門氏菌液平板培養(yǎng)計數(shù)。

捕獲率=下沉細(xì)菌總數(shù)/（上清細(xì)菌總數(shù)+下沉細(xì)菌總數(shù)）。

1.2.3 捕獲率考察AllMag PM3-2磁球、Dynabeads Myone Carboxyl各 50、100、200、400 μg分別與25 μg anti-Salmonella多克隆抗體反應(yīng)制備免疫磁球，與稀釋好的不同濃度沙門氏菌104、103、102、101cfu/mL在室溫下溫育、捕獲及磁分離，方法同1.2.2，通過平板培養(yǎng)計數(shù)法計算不同濃度免疫磁球?qū)Σ煌瑵舛壬抽T氏菌的捕獲率。取捕獲后適量免疫磁球/細(xì)菌復(fù)合物SEM表征。

1.2.4 特異性考察分別稀釋培養(yǎng)好的大腸埃希菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌菌液約102cfu/mL，形成原始菌液，取原始菌液各1 mL放入2 mL離心管中，加入200 μg anti-Salmonella免疫磁球，輕輕吹打均勻；在室溫下輕輕旋轉(zhuǎn)30 min后；將離心管置于磁力架上，至離心管溶液清澈透明；小心取出離心管中全部清液 （上清液）；去磁場后，加1 mL PBS緩沖液反復(fù)沖洗離心管壁上的菌體-免疫磁球復(fù)合物，并均勻打散（下沉液）；將上清液與下沉液分別涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，在各自的培養(yǎng)條件下，經(jīng)過24～48 h培養(yǎng)；同時將原始菌液分別涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，在相同的條件下培養(yǎng)，進(jìn)行菌落計數(shù)并計算捕獲率（捕獲率計算方法同1.2.2）。

1.2.5 敏感性考察將培養(yǎng)好的沙門氏菌液稀釋至約100、108cfu/mL形成原始菌液，取原始菌液各1 mL，放入2 mL離心管中，分別加入200 μg anti-Salmonella免疫磁球，溫育、捕獲，磁分離。方法同1.2.2，通過平板培養(yǎng)計數(shù)法計算免疫磁球?qū)?00、108cfu/mL沙門氏菌的捕獲率。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫磁球磁分離時間

在外加磁場的情況下（0.5 T），粒徑為180 nm anti-Salmonella免疫磁球磁分離時間在20min時對目標(biāo)菌的捕獲率達(dá)到最高（40.13%），隨時間的增加逐漸趨于平衡，見圖1。粒徑為1 000 nm的免疫磁球在15 min時對目標(biāo)菌的捕獲率達(dá)到最高（57.68%），后隨著磁分離時間的增加，捕獲率呈下降趨勢，見圖2。

圖1 免疫磁球在外加磁場作用下富集情況Fig.1 Immunomagnetic beads enriched under an applied magnetic field

圖2 anti-Salmonella免疫磁球在不同磁分離時間目標(biāo)菌捕獲率Fig.2 Capture rate of anti-Salmonella immunomagnetic beads on target bacteria in different magnetic separation time

2.2 免疫磁球目標(biāo)物捕獲率

通過平板培養(yǎng)計數(shù)法評價免疫磁球目標(biāo)菌捕獲性能見圖3。50、100、200、400 μg anti-Salmonella免疫磁球?qū)δ繕?biāo)菌101～104cfu/mL的捕獲率逐漸增加；顯然，隨著免疫磁球數(shù)量的增加，其對目標(biāo)物的捕獲率增大，200 μg免疫磁球的捕獲率在50%以上，增加免疫磁球用量至400 μg以后，其捕獲率與用量200 μg捕獲率基本相當(dāng)。anti-Salmonella免疫磁球（200 μg）及抗體（25 μg）為最佳投料比，用于后續(xù)的試驗。兩種免疫磁球捕獲率有所差別，沙門氏菌菌落數(shù)一定時，粒徑為180 nm免疫磁球比粒徑為1 000 nm免疫磁球捕獲率高。通過SEM手段評價了磁球與沙門氏菌復(fù)合體的結(jié)合情況，免疫磁球與沙門氏菌相互作用，磁球穩(wěn)定結(jié)合于目標(biāo)菌表面，見圖4。

圖3 不同質(zhì)量免疫磁球?qū)Σ煌瑪?shù)量目標(biāo)菌捕獲率Fig.3 Capture rate of different quality immunomagnetic beads on different number of target bacteria

圖4 免疫磁球與目標(biāo)菌復(fù)合物SEM照片F(xiàn)ig.4 SEM of immunomagnetic beads and the target bacteria complexes

2.3 免疫磁球特異性

免疫磁球的特異性評價通過其對非目標(biāo)菌的非特異性吸附來間接體現(xiàn)。anti-Salmonella免疫磁球?qū)卧隼钏固鼐?、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌捕獲都在10%以下，免疫磁球?qū)Τ抽T氏菌之外的其它菌都有交叉反應(yīng)，存在一定的非特異捕獲現(xiàn)象，見表1。

2.4 免疫磁球敏感性

如圖5所示，兩種免疫磁球?qū)τ谀繕?biāo)菌濃度為100cfu/mL時的捕獲率高于對 108cfu/mL的捕獲率；AllMag PM3-2 anti-Salmonella免疫磁球?qū)?00、108cfu/mL目標(biāo)菌的捕獲率分別為 73%、43%；Dynabeads anti-Salmonella免疫磁球?qū)?00、108cfu/ mL目標(biāo)菌的捕獲率分別為51%、24%。表明目標(biāo)菌濃度越小，捕獲效率越高，敏感性越好。

表1 anti-Salmonella免疫磁球?qū)Σ煌辏?02cfu/mL）捕獲率Table 1 Rate of anti-Salmonella immunomagnetic beads capturing on different strains（102cfu/mL）

圖5 免疫磁球?qū)?00、108cfu/mL目標(biāo)菌的捕獲率Fig.5 Capture rate of anti-Salmonella immunomagnetic beads on the concentration of 100cfu/mL and 108cfu/mL

2.4 討論

免疫磁球性能受多方面因素影響，磁球本身粒徑、磁球表面抗體固定量、抗體活性、磁響應(yīng)時間等為主要因素。

磁響應(yīng)時間是免疫磁球最基本的性能，它反映了免疫磁球在盡可能短的時間內(nèi)分離出目標(biāo)物的能力，作者通過在不同磁分離時間下目標(biāo)菌的捕獲率對其進(jìn)行表征。由于磁球本身磁含量及粒徑的不同，兩種免疫磁球在相同的磁分離時間內(nèi)表現(xiàn)出不同的捕獲率，Dynabeads anti-Salmonella免疫磁球在捕獲率達(dá)到最大后又開始下降，推測主要是由于粒徑與質(zhì)量大，在與目標(biāo)菌長時間的接觸過程中，由于重力或磁力作用對目標(biāo)菌造成損傷，所以，應(yīng)在恰當(dāng)?shù)臅r間及時停止磁分離操作，保證目標(biāo)物的捕獲效率。在實際研究或檢測工作中，能將目標(biāo)物捕獲并快速地分離呈遞給后續(xù)方法以定性或定量檢測，節(jié)約樣品的前處理時間，對科研工作及檢測工作具有非常重要的意義。尤其是對于食品樣品中的微生物檢測工作來說，免疫磁球?qū)⒛繕?biāo)菌盡可能有效地捕獲后快速分離，能節(jié)約檢測時間18～24 h[6]，大大提高了工作效率。

本研究對各種影響因素的表征都采用了目標(biāo)菌捕獲率技術(shù)參數(shù)，因為每個影響因素對目標(biāo)物的作用最終都會反映到捕獲率上。捕獲率的計算方法因不同的捕獲目標(biāo)物而異，對于微生物富集用免疫磁球采用微生物平板培養(yǎng)計數(shù)法能準(zhǔn)確計算捕獲率，而且能真實反應(yīng)捕獲活菌的數(shù)量；細(xì)胞富集用免疫磁球可采用流式細(xì)胞儀來確定捕獲率。作者特別選取兩種粒徑不同的免疫磁球來考察其捕獲效果。結(jié)果顯示，當(dāng)磁球表面抗體一定的情況下，小粒徑（180 nm）的免疫磁球?qū)Υ蠓肿幽繕?biāo)菌的捕獲率要高于大粒徑（1 000 nm）的免疫磁球，主要因為小粒徑的免疫磁球比表面積大，表面連接的抗體數(shù)量多而導(dǎo)致高的捕獲效率；另一方面，大粒徑免疫磁球由于受重力的作用很容易沉淀，在反應(yīng)過程中不能與目標(biāo)菌充分接觸，即使接觸到目標(biāo)物，也會由于其重力作用使目標(biāo)物受到損傷，從而影響其對目標(biāo)菌的捕獲性能。有研究證實，較小的粒徑及良好的膠體穩(wěn)定性能大大提高免疫磁球與目標(biāo)菌的免疫反應(yīng)，從而表現(xiàn)出較高的捕獲率[7]。對于大分子微生物來說，納米級免疫磁球表現(xiàn)出更高的捕獲性能[8]。

許多文獻(xiàn)中報道所制備的免疫磁球目標(biāo)物捕獲率達(dá)到80%以上[9-14]，本研究中制備的免疫磁球?qū)δ繕?biāo)菌的捕獲率最高為76%，主要因為磁球表面偶聯(lián)的抗體量不同，目標(biāo)物捕獲率表現(xiàn)出高低不同。本研究抗體投料僅為25 μg制備的免疫磁球，獲得了較高的捕獲率，對以后的產(chǎn)品應(yīng)用轉(zhuǎn)化、降低產(chǎn)品成本具有非常重要的現(xiàn)實意義。

3 結(jié)語

作者通過化學(xué)鍵法制備沙門氏菌捕獲富集用免疫磁球，通過平板培養(yǎng)計數(shù)法確定其對目標(biāo)菌捕獲率，重點(diǎn)對影響免疫磁球性能的磁分離時間、目標(biāo)菌捕獲率、特異性及敏感性等主要技術(shù)參數(shù)作了考察。不同的磁分離時間影響免疫磁球捕獲率，在最佳的時間內(nèi)，捕獲率達(dá)到最高；磁球表面抗體的特異性、與菌體的免疫反應(yīng)性也是影響免疫磁球性能的重要因素。本研究為免疫磁球性能評價及實際應(yīng)用檢測提供了科學(xué)依據(jù)，同時為國產(chǎn)免疫磁球的應(yīng)用轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。

[1]Ugelstad A.Process for preparing an aqueous emulsion or dispersion of a party water-soluble material and use of polymer particles prerared according to this process as a toner in xerography[P].European Patent：0003905，1979-09-05.

[2]Maciej Z，Chalmers J J，Rare C.Rare cell separation and analysis by magnetic sorting[J].Anal Chem，2011，83（1）：8050-8056.

[3]Chinchun O，Christopher M E，Robert J W.Effect of magnetic field gradient on effectiveness of the magnetic sifter for cell purification[J].IEEE Trans Magn，2013，49（1）：316-320.

[4]Yoshiaki O，Tomoko Y T，Nozomi K，et al.New protein purification system using gold-magnetic beads and a novel peptide tag“the Methionine Tag”[J].Bioconjugate Chem，2011，22（5）：887-893.

[5]Shao M F，Ning F Y，Zhao J W，et al.Preparation of Fe3O4、SiO2、layered double hydroxide core-shell microspheres for magnetic separation of proteins[J].J Am Chem Soc，2012，134（2）：1071-1077.

[6]Zhouli Wang，Tianli Yue，Yahong Yuan，et al.Preparation of immunomagnetic nanoparticles for the separation and enrichment of Alicyclobacillus spp.in apple juice[J].Food Research International，2013，54（1）：302-310.

[7]牛牧，杜美紅，鄧奕，等.亞微米級免疫磁球及其在細(xì)菌分離中的應(yīng)用[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2011，32（2）：322-326.

NIU Mu，DU Meihong，DENG Yi，et al.Preparation and application in capturing bacteria of submicron immunomagnetic beads [J].Chemical Journal of Chinese Universities，2011，32（2）：322-326.（in Chinese）

[8]梁光明，劉陽，孫力軍，等.利用人免疫球蛋白構(gòu)建免疫磁珠富集金葡菌條件優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2013，32（3）：265-271.

LIANG Guangming，LIU Yang，SUN LiJun，et al.Condition optimization of building immunomagnetic bead using humanimmunoglobulin G for enrichment Staphylococcus aureus[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2013，32（3）：265-271.（in Chinese）

[9]聞一鳴，李志清，童吉宇，等.免疫磁珠富集技術(shù)聯(lián)合選擇性培養(yǎng)基快速檢測單增李斯特菌[J].生物工程學(xué)報，2013，29（5）：672-680.

WEN Yiming，LI Zhiqing，TONG Jiyu，et al.Rapid detection of Listeria monocytogenes by immunomagnetic separation combined with selective medium[J].Chinese Journal of Biotechnology，2013，29（5）：672-680.（in Chinese）

[10]Burcu Guven，Nese Basaran-Akgul，Erhan Temur，et al.SERS-based sandwich immunoassay using antibody coated magnetic nanoparticles for Escherichia coli enumeration[J].Analyst，2011，136（4）：740-748.

[11]Somayyeh Poshtiban，Muhammad Afzal Javed，Denis Arutyunov，et al.Phage receptor binding protein-based magnetic enrichment method as an aid for real time PCR detection of foodborne bacteria[J].Analyst，2013，138（19）：5619-5626.

[12]Longyan Chen，F(xiàn)ereidoon S Razavi，Abdul Mumin，et al.Muitifunctional nanoparticles for rapid bacterial capture，detection，and decontamination[J].RSC Adv，2013，3（7）：2390-2397.

[13]Zhao W，Zhang W P，Zhang Z L，et al.Robust and highly sensitive fluorescence approach for point-of-care virus detection based on immunomagnetic separation[J].Anal Chem，2012，84（5）：2358-2365.

[14]Kai Ma，Yi Deng，Yu Bai，et al.Rapid and simultaneous detection of Salmonella，Shigella，and Staphylococcus aureus in fresh pork using a multiplex real-time PCR assay based on immunomagnetic separation[J].Food Control，2014，42：87-93.

Factors Effected on Performance of Immunomagnetic Beads for Bacteria Enrichment

DU Meihong1， DAI Fengying2， XU Dixin3， ZHANG Miao2， SNN Yongjun1， ZUO Jia1
（1.Beijing CenterforPhysicaland ChemicalAnalysis，Beijing 100089，China；2.Institute ofProcess Engineering，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190， China；3.Beijing Scientific Instruments and Materials Cooperation，Beijing 100010，China）

In this study，we aims to study the main factors such as magnetic separation time，target capture rate，specificity，sensitivity that affect the performance of immunomagnetic beads（IMB）. IMB were prepared chemically and the capture rate of target bacteria were determined by plate culture counting.The target bacteria capture rate varies in different magnetic separation time，which affected the capture rate，and the capture rate of IMB would reach the highest level.The amount of magnetic balls and antibody affect the capture performance of IMB.When the Feed ratio was 200 μg of magnetic ball and 25 μg of antibody，the capture rate would get more than 50%And IMB hasa sensitivity （the capture rate is above 50%on target bacteria with 100 cfu/mL）.The target capture rate of IMB with the large diameter（1 000 nm）is less than that of those with the small diameter（180 nm）at the same mass.The nonspecific capture rate for Escherichia coli，Staphylococcus aureusand Shigella was below 10%，which affected the immune specificity of IMB.This study provided a foundation and some data for application of IMB and detection of microorganisms.

immunomagnetic beads（IMB），capture rate，magnetic separation time，specificity，sensitivity

Q 939.91

A

1673—1689（2015）05—0501—06

2014-02-28

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAF14B02）;國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項項目（2013YQ140371）;北京市科學(xué)技術(shù)研究院創(chuàng)新團(tuán)隊項目（IG201307N/C2）。

杜美紅（1974—），女，山西太谷人，理學(xué)博士，副研究員，主要從事食品安全及微生物快速檢測方面的研究。

E-mail:dumeihong@tom.com