鐮刀菌Fusariumsp sp.JN 158色素的鑒定及其抗腫瘤活性

鄭里翔， 蔡宇杰， 徐敏娟， 李昌偉，王巧鳳， 王 月， 孟憲明， 廖祥儒*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 南昌330004）

鐮刀菌Fusariumsp sp.JN 158色素的鑒定及其抗腫瘤活性

鄭里翔1，2， 蔡宇杰1， 徐敏娟2， 李昌偉1，王巧鳳2， 王 月2， 孟憲明2， 廖祥儒*1

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 南昌330004）

通過對(duì)鐮刀菌發(fā)酵所產(chǎn)色素的分離及結(jié)構(gòu)的分析，篩選其抗腫瘤的活性成分。采用形態(tài)與分子生物學(xué)方法對(duì)鐮刀菌株鑒定，利用HPLC的對(duì)該菌株發(fā)酵所產(chǎn)的色素進(jìn)行分離，分離的產(chǎn)物用紫外、紅外、核磁進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，使用MTT的方法篩選抗腫瘤的活性成分。結(jié)果表明：該鐮刀菌所產(chǎn)色素共6個(gè)不同的峰，相對(duì)分子質(zhì)量均在380左右，其中VI號(hào)峰結(jié)構(gòu)新穎，為花青苷類色素，分子式為C17H18O10，能抑制A539、MCF-7、MKN-45、HepG2、SW620五種不同腫瘤細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)濃度的依賴性，其中MCF-7乳腺癌細(xì)胞抑制最明顯（P＜0.01），故VI號(hào)峰色素可能是一種很有前景的防治乳腺癌的化合物。

鐮刀菌；色素；結(jié)構(gòu)；抗腫瘤

色素廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)藥等行業(yè)，色素一般分為天然色素和合成色素。天然色素主要來源于植物、動(dòng)物和微生物等，一般具有營(yíng)養(yǎng)保健功能；合成色素雖然有很多優(yōu)點(diǎn)，但有毒性和致癌性，因此，合成色素正逐漸被天然色素取代。微生物色素是天然色素的重要發(fā)展方向，可以不受季節(jié)、材料等限制，可連續(xù)不斷的發(fā)酵生產(chǎn)，能滿足日益增加的社會(huì)需求，而且大部分微生物色素具有一定的生物學(xué)活性[1-4]。

鐮刀菌作為一類在自然界中廣泛存在和分布的真菌微生物，對(duì)其研究主要集中在致病機(jī)理上。近年來，隨著人們對(duì)于天然色素需求的增加，對(duì)鐮刀菌所產(chǎn)的色素也引起人們的關(guān)注，開發(fā)利用也逐漸增加[5-6]。而鐮刀霉菌產(chǎn)色素抗腫瘤的報(bào)道很少。作者將傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，對(duì)該鐮刀菌進(jìn)行了鑒定；同時(shí)對(duì)鐮刀菌所產(chǎn)的色素進(jìn)行分離和結(jié)構(gòu)的鑒定，并對(duì)部分成分進(jìn)行抗腫瘤的活性研究。

1 材料與方法

1 1主要儀器與試劑

1.1.1 儀器超凈工作臺(tái) （SW-CJ-1f）：蘇州凈化廠；回轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床（HZC-250）：廣州醫(yī)療器材廠；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（LHS-250 HC）：蘇州醫(yī)療器材廠；分光光度計(jì)（UV-3000）：日本日立公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋（YXD-LS-60）：江蘇儀器廠；液質(zhì)聯(lián)用儀（Waters Platform ZMD4000）：美國(guó)waters公司；核磁共振儀（AVANCE III 400 MHz）：傅立葉紅外光譜儀（NICOLET NEXUS 470）：美國(guó)；冷凍干燥機(jī)（EZ585Q）：江蘇吳中；掃描電子顯微鏡 （Quata-200）：日本三菱。

1.1.2 試劑葡萄糖、果糖、乳糖、D-半乳糖、甘油、蔗糖、麥芽糖、尿素、硫酸銨、丙酮、氯仿、無水乙醇、鹽酸、異丙醇、二甲基亞砜（DMSO）、檸檬酸、苯甲酸鈉、三氟乙酸（TFA），以上均為分析純，購自上海國(guó)藥集團(tuán)；四甲基偶氮唑鹽（MTT）：購自美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 鐮刀霉菌培養(yǎng)基

1）PDA斜面培養(yǎng)基 （g/L）：土豆200，葡萄糖20，瓊脂20，pH自然；

2）種子培養(yǎng)基（g/L）：土豆 200，葡萄糖20，pH自然；

3）液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：土豆200，葡萄糖20，牛肉膏3，pH自然。

1.2.2 菌株的形態(tài)學(xué)特征將供試菌株接種在培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)，對(duì)病原菌在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、生長(zhǎng)情況、顏色以及孢子形狀、大小、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等進(jìn)行觀察，將菌株的菌絲、孢子用電子顯微鏡及光學(xué)顯微鏡（石碳酸-棉藍(lán)染色）觀察，并拍照記錄，并依據(jù)鐮刀菌的分類系統(tǒng)[7-9]，對(duì)鐮刀菌菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定采用CTAB法[10]提取鐮刀菌基因組RNA，使用真菌26 rRNA基因間隔區(qū)通用引物（ITS1/ITS4）[11]，對(duì)鐮刀菌分離物的基因組rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，序列全長(zhǎng)為606 bp，測(cè)序，獲得的 ITS序列在 GenBank數(shù)據(jù)庫（http：//www. ncbi.nim.nih.gov／blast）中進(jìn)行同源性比較。

1.2.4 鐮刀霉菌的培養(yǎng)及色素提取從斜面培養(yǎng)基上挑取一小塊菌落，轉(zhuǎn)接到有種子培養(yǎng)基的三角瓶（250 mL三角瓶中裝液量50 mL），30℃下旋轉(zhuǎn)式搖床以200 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)36 h，以5%的接種體積分?jǐn)?shù)接種到50 L的發(fā)酵罐中發(fā)酵72 h。

發(fā)酵液經(jīng)10 000 g離心10 min，收集紫色菌體，加入4倍體積的95%酸性乙醇溶液 （乙醇-鹽酸=9∶1）浸提過夜，得到色素提取液，用1 mol/L NaOH調(diào)PH至7.8左右，離心得到紫色沉淀，即得色素粗品。

1.2.5 色素的HPLC分離分離條件：色譜柱Phecda C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），柱溫25℃；DAD檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相A為含體積分?jǐn)?shù)0.1%TFA（氟乙酸）的乙腈，流動(dòng)相B為含體積分?jǐn)?shù)0.1%TFA的蒸餾水，梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度程序Table Gradient program of mobile phase

1.2.6 鐮刀霉菌發(fā)酵產(chǎn)紫色素結(jié)構(gòu)的分析

1）紫外光譜分析：取紫色素純品2 mg溶于乙腈-三氟乙酸 （10∶1）中，通過 Waters Platform ZMD4000進(jìn)行液質(zhì)分析，液相掃描選擇的波長(zhǎng)為200～750 nm，然后利用Masslynx V4.1軟件分析出該色素紫外圖譜。

2）紅外光譜分析（IR）：取紫色素純品2 mg，與200 mg干燥的KBr研磨混勻，用傅立葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1區(qū)間掃描，掃描次數(shù)：32次，分辨率：4 cm-1。

3）核磁共振（NMR）分析：用氘代三氟乙酸將待測(cè)樣品溶于5 mm標(biāo)準(zhǔn)的NMR管中，加入少量TMS作為基準(zhǔn)參照物進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 MTT比色法測(cè)定色素對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖的影響用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)肺腺癌細(xì)胞A539、乳腺癌MCF-7、人胃癌細(xì)胞MKN-45、肝癌HepG2細(xì)胞株、大腸癌細(xì)胞株SW620等5種不同的細(xì)胞株 （上述細(xì)胞均購于上海細(xì)胞所），MTT方法參照文獻(xiàn)[12]，將制好的含細(xì)胞的完全培養(yǎng)液加入96孔培養(yǎng)板中，色素終濃度分別為5、10、15 μmol/L，對(duì)照組加入含等體積鹽酸乙醇的新鮮完全培養(yǎng)液200 μL；陽性藥物烏苯美司終濃度為（IC50）10 mmol/L，對(duì)照組含1%的醋酸培養(yǎng)液[13]。每組均為15個(gè)復(fù)孔，選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度（A）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間比較將采用LSD、Hochberg's GT2、Games-Howell統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。取α=0.05做為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，以P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板生長(zhǎng)特性

將鐮刀菌株接種于PDA固態(tài)培養(yǎng)基的平皿中，30℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌體生長(zhǎng)狀態(tài)。培養(yǎng)3～4 d后，菌落中央的菌絲體頂部呈白色叢毛突起，菌落邊緣整齊，菌絲體呈白色絨毛狀，菌落背面呈紫色；7～8 d后，氣生菌絲發(fā)達(dá)，密集叢立，少匍匐，菌落致密，質(zhì)地呈棉絮狀平展，菌落上有一層白色孢子，菌落和培養(yǎng)基緊密連接，難以挑取，無滲出液，無特殊氣味。

2.2 顯微形態(tài)特征

鏡下觀察發(fā)現(xiàn)透明分隔狀菌絲，有頂生、間生的厚壁孢子和較多腎形小分生孢子，呈頭狀著生于不分支的分生孢子梗上，大分生孢子多見，呈鐮刀狀，兩頭尖，2～4個(gè)分隔，無足細(xì)胞或頂端突起。根據(jù)菌體形態(tài)特征的研究，查閱《真菌鑒定手冊(cè)》[14]和《中國(guó)真菌志》[15]，初步鑒定菌株為鐮刀霉菌JN158。

2.3 鐮刀菌株JN158的rRNA基因間隔序列測(cè)定

通過PCR擴(kuò)增得到的26S rRNA基因間隔序列的D1/D2區(qū)，序列全長(zhǎng)為606 bp，見圖1。經(jīng)GenBank，其登錄號(hào)為HQ265299。根據(jù)BLAST結(jié)果，取相似度較高的序列列表，見表2。通過表2的分析發(fā)現(xiàn)，與Fusarium sp的26S r RNA基因其相似度為100%，因此結(jié)合菌株的形態(tài)特征，確定菌株JN158屬于鐮刀霉菌屬，命名為Fusarium sp JN158。

2.4 利用HPLC對(duì)Fusarium sp.JN158產(chǎn)色素的分離純化

本實(shí)驗(yàn)HPLC選用C18柱，對(duì)色素分離效果較好，由圖2可看出有6個(gè)峰，與LC/MS分析的出峰數(shù)基本上一致（數(shù)據(jù)未顯示），分別標(biāo)記成Ⅰ～Ⅵ（圖2a），Ⅵ峰的峰相對(duì)最高（圖2b），與周圍雜峰距離也較遠(yuǎn)，該組分較易分離純化，所以只對(duì)這一組分進(jìn)行了制備。

2.5 Fusarium sp.JN158紫色素結(jié)構(gòu)的鑒定

2.5.1 紫色素的紫外光譜分析早期對(duì)有色的有機(jī)化合物研究發(fā)現(xiàn)，顏色的發(fā)生與分子中存在不飽和基團(tuán)或體系有關(guān)如＞C=C＜、＞C=O、—N=N—、苯環(huán)等，把這些基團(tuán)或體系稱為生色團(tuán)。紫外光譜僅提供分子中的共軛體系和某些基團(tuán)的結(jié)構(gòu)信息。通過LC/MS的分析，得到該色素的紫外吸收光譜見圖3?？梢钥闯觯摶衔镌谧贤鈪^(qū)有兩條吸收帶，分別為253 nm和274 nm，可初步判斷該色素是一種帶苯環(huán)的化合物。

圖1 鐮刀菌Fusarium JN158 26S rRNA基因間隔區(qū)序列Fig.1 Gene sequence of Fusarium sp JN158 26S rRNA Spacer

表2 用于同源比對(duì)的鐮刀菌 （Fusarium）真菌的RNA序列Table 2 RNA sequences from Fusarium used for alignment with the new sequence

圖2 HPLC分離色素Fig.2 HPLC separate pigment

2.5.2 紫色素的質(zhì)譜分析一級(jí)質(zhì)譜主要是用于分析目標(biāo)分子的相對(duì)分子質(zhì)量，該紫色素的一級(jí)質(zhì)譜圖見圖4，可以看出該色素的相對(duì)分子質(zhì)量為382.0。

圖3 紫色素的光譜掃描圖Fig.3 Spectrum of purple pigment

圖4 Fusarium JN158紫色素的正離子質(zhì)譜圖Fig.4 MS spectra of purple pigment from Fusarium JN158

2.5.3 紫色素的紅外光譜分析紅外光譜是記錄有機(jī)分子吸收紅外光后產(chǎn)生化學(xué)鍵振動(dòng)而形成的光譜吸收，測(cè)定范圍一般為4 000～400 cm-1，常用來確定各種羧基、烷烴、芳環(huán)及炔烴等基團(tuán)的特征吸收峰?；鶊F(tuán)頻率區(qū)在4 000～1 300 cm-1之間，在1 800 cm-1（1 300 cm-1）～600 cm-1區(qū)域內(nèi)，除單鍵的伸縮振動(dòng)外，還有因變形振動(dòng)產(chǎn)生的譜帶。O—H基的伸縮振動(dòng)出現(xiàn)在3 650～3 200 cm-1范圍內(nèi)；-CH2基的吸收峰出現(xiàn)在2 930 cm-1和2 850 cm-1附近；C=O伸縮振動(dòng)出現(xiàn)在1 900～1 650 cm-1范圍內(nèi)；苯的衍生物的泛頻譜帶，出現(xiàn)在2 000～1 650 cm-1范圍，是C—H面外和C=C面內(nèi)變形振動(dòng)的泛頻吸收；頻率范圍在1 500～1 300 cm-1為C—H彎曲振動(dòng)區(qū)；酚的相應(yīng)譜帶在較高頻率1 200～1 280 cm-1；醇的C—O出現(xiàn)在1 000～1 200 cm-1。結(jié)合圖5，該紫色素的紅外光譜分析結(jié)果匯總見表3。

2.5.4 紫色素的核磁共振（NMR）分析

1）1H核磁共振圖譜分析：從圖譜的位移值及峰形來看，化學(xué)位移11.500為烯醇的H；化學(xué)位移5.384與芳環(huán)中的羥基中的H一致；化學(xué)位移3.908為醇羥基中的H；化學(xué)位移4.550為甲氧基相連的CH2中的H；化學(xué)位移4.053與羥基相連的CH2的H一致；化學(xué)位移4.486為C=C—OCH3中的H；化學(xué)位移3.527為C—C—OCH3中的H。

2）13C核磁共振圖譜分析：從圖譜的位移值及峰形來看，化學(xué)位移178.67、176.12與羧基中的C一致；化學(xué)位移53.12、53.71、55.68為甲氧基中的C，表明該色素含有3個(gè)甲氧基，其中2個(gè)是對(duì)位的，與氫譜結(jié)果一致；化學(xué)位移157.42為苯環(huán)中與羥基相連的C；化學(xué)位移為C=C中接羥基的碳；化學(xué)位移56.27與C—OH中的C一致。

表3 Fusarium sp.JN158紫色素的紅外光譜分析結(jié)果Table 3 IR spectrum results of purple pigment from Fusarium sp.JN158

結(jié)合紫色素的性質(zhì)及質(zhì)譜與紅外的光譜分析，通 過 COSY （Correlated Spectroscopy）、HMQC（Heteronuclear Multiple Quantum Coherece）、ROESY（Rotaing Frame Overhauser Efect Spectroscopy）及MLEV[M.Levitt（broadband composite decoupling sequence）]對(duì)1H、13C核磁共振譜峰進(jìn)行準(zhǔn)確的歸屬，確定了該色素的相對(duì)分子質(zhì)量為382.0，分子式為C17H18O10，結(jié)構(gòu)為：

2.6 鐮刀霉菌產(chǎn)VI號(hào)化合物對(duì)不同瘤株細(xì)胞增殖的影響

MTT比色實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)Fusarium sp.JN158產(chǎn)VI號(hào)化合物對(duì)MCF-7、A549、NKM-45、SW 620結(jié)腸癌細(xì)胞、HePG2肝癌細(xì)胞5種腫瘤細(xì)胞增殖的影響，使用5、10、15 μmol/L 3個(gè)不同濃度的VI號(hào)化合物和烏苯美司（IC5010 mmol//L）作用于腫瘤細(xì)胞24 h，烏苯美司（Ubenimex）是從網(wǎng)狀橄欖鏈霉菌培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的一種具有抗菌作用和免疫增強(qiáng)作用的小分子二肽化合物，相對(duì)分子質(zhì)量與VI相似，已有體外研究表明，烏苯美司可誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞、人白血病細(xì)胞等凋亡。

通過酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀而測(cè)出的490 nm波長(zhǎng)下的各組吸光度（A）值，見表4。

可以看出，VI號(hào)化合物對(duì)MCF-7、MKN-45、A549、SW 620、HePG2均有不同的抑制作用，并呈現(xiàn)濃度的依賴性，其中MCF-7有明顯的抑制作用。在相同濃度的情況下，色素對(duì)所有腫瘤細(xì)胞的抑制均要優(yōu)于陽性藥物—烏苯美司，對(duì)正常人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）沒有影響（數(shù)據(jù)沒有在表中列出），提示VI號(hào)化合物可能是一種有應(yīng)用開發(fā)前景的抗腫瘤化合物。

3 結(jié)語

本研究使用的霉菌是根據(jù)霉菌的形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀的觀察結(jié)果，參照Booth的鐮刀菌分類系統(tǒng)及其生物學(xué)特點(diǎn)，根據(jù)26SRNA間隔測(cè)序的結(jié)果，判斷為Fusarium sp.B158鐮刀菌。

鐮刀菌 Fusarium sp.B158發(fā)酵所使用的培養(yǎng)基只需要葡萄糖和土豆，培養(yǎng)基所用的成本低廉。發(fā)酵的產(chǎn)物在酸性乙醇中（pH 1.5左右）呈現(xiàn)紅色，在堿性條件下（pH 7～8）變成紫黑色，并有結(jié)晶沉淀。該色素不溶于水，可溶于酸性乙醇。

表4 VI號(hào)化合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖的影響（x±s）Table 4 Effect of different cancer cell proliferation from NO.6 compound

通過色素的液相分離和制備實(shí)驗(yàn)，選擇最佳流動(dòng)相和最佳洗脫程序，分離得到6個(gè)峰，其中VI號(hào)峰遠(yuǎn)離其余的峰，通過液相制備系統(tǒng)制得純度約98%。

質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)可知VI號(hào)峰的相對(duì)分子質(zhì)量為382，結(jié)合有機(jī)元素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，推測(cè)可能的分子式是C17H18O10，是花青苷類色素。通過科技查新可知：沒有這種相對(duì)分子質(zhì)量的分子式報(bào)道，故VI號(hào)峰的色素可能是一種新的化合物。

為證實(shí)該色素的功效特點(diǎn)，選擇常見的5種瘤株，測(cè)定VI號(hào)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這個(gè)化合物對(duì)上述5種腫瘤細(xì)胞瘤株均具有抑制作用，而對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞抑制最為明顯（P＜0.05），而對(duì)正常細(xì)胞沒有毒性作用（結(jié)果未在文章中顯示），提示這可能是一種潛在的有開發(fā)前景的防治乳腺癌的化合物。

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Pigment Production by Fermentation of Fusarium（Fusarium sp.JN158）and It's Anti-Cancer Activity

ZHENG Lixiang1，2， CAI Yujian1， XU Minjuan2， LI Changwei1，WANG Qiaofeng2， WANG Yue2， MENG Xianming2， LIAO Xiangru*1
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Basic Medicine，Jiangxi University，Nanchang 330004，China）

Through the separation and structural analysis of the pigment produced by Fusarium fermentation，the research aims to screen the anti-tumor active components.Fusarium was identified by using morphological and molecular biology methods.The pigmen was isolated by HPLC，the production structure was identified by UV，IR，NMR.，and the screening of anti-tumor activity was by MTT.The results showed that the pigment from Fusarium produced a total of six different peaks，the molecular weight is about 380，the VI peak，which is the anthocyanins，can inhibit the A539，MCF-7，MKN-45，HepG2，SW620 five different tumor cell proliferation in a concentrationdependent manner，among them MCF-7 breast cancer cells were inhibited most（P＜0.01），so the VI compound with a new structure from Fusarium sp JN 158，may be a good treatment for breast cancer.

Fusarium，pigment，structure，anti-tumor

R 915

A

1673—1689（2015）02—0463—07

2014-01-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（8116031）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（2013）。

鄭里翔（1965—），男，江西南昌人，醫(yī)學(xué)碩士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事分子腫瘤方面的研究。E-mail：zlx000168@126.com

*通信作者：廖祥儒（1964—），男，江西贛州人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事發(fā)酵工程方面的研究。

E-mail：13771104596@163.com