重組尿酸酶發(fā)酵培養(yǎng)及制備的工藝條件

趙 明， 何中杰， 王 瑞， 姚明東， 師 慧， 王振偉， 孟 堯*

（1.成都醫(yī)學(xué)院 檢驗醫(yī)學(xué)院，成都 610500；2.四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都610064）

重組尿酸酶發(fā)酵培養(yǎng)及制備的工藝條件

趙 明1， 何中杰1， 王 瑞1， 姚明東1， 師 慧2， 王振偉2， 孟 堯*1

（1.成都醫(yī)學(xué)院 檢驗醫(yī)學(xué)院，成都 610500；2.四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都610064）

利用含PET-Urate Oxidase表達(dá)質(zhì)粒的重組E.coli JM109（DE3）菌株進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，擬建立一種高效、低成本的生產(chǎn)重組尿酸酶的技術(shù)工藝路線。取凍存的工程菌接種于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂的種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，從劃線平板上挑取單菌落接種于搖瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，最后以體積分?jǐn)?shù)5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，繪制生長曲線；以乳糖作為誘導(dǎo)劑與傳統(tǒng)IPTG誘導(dǎo)方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)比較；菌體經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)破碎、質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%～60%硫酸銨分級沉淀，以及Q-Sepharose F.F.層析進(jìn)行分離純化。結(jié)果顯示，乳糖作為誘導(dǎo)劑在300 L的發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)可獲得菌體濕質(zhì)量2 700 g，目的蛋白質(zhì)表達(dá)量占菌體可溶性蛋白質(zhì)的30%左右，略高于IPTG誘導(dǎo)的效果；經(jīng)分離純化后該酶的純化倍數(shù)可達(dá)原來的4.5倍，活性回收率為40%；純化的重組尿酸酶經(jīng)SDS-PAGE和HPLC分析，顯示單一蛋白質(zhì)色帶和單一洗脫峰。成果為該酶的醫(yī)學(xué)實際應(yīng)用奠定了理論實驗基礎(chǔ)。

重組尿酸酶；乳糖；誘導(dǎo)表達(dá)；發(fā)酵；純化

尿酸酶（Urate Oxidase，Uricase；EC1.7.3.3）是生物體內(nèi)嘌呤代謝途徑中的一種酶，可將尿酸氧化分解為尿囊素、二氧化碳和過氧化氫[1]。人體中缺乏尿酸酶，嘌呤代謝終產(chǎn)物尿酸及其鹽類在血液中溶解度很低，當(dāng)人體中尿酸水平高于正常水平時，就會引發(fā)高尿酸血癥，繼而誘發(fā)痛風(fēng)等一系列疾病[2-3]；臨床上尿酸酶可以作為治療高尿酸血癥的藥物，也可用于配制診斷試劑盒檢測樣本中尿酸的濃度，因此尿酸酶是一種重要的醫(yī)藥用酶，有較高的市場價值[4-6]。國內(nèi)雖然也有相關(guān)尿酸酶基因克隆高效表達(dá)的報道[7]，但商品化程度遠(yuǎn)不如國外，還需要大量進(jìn)口以滿足臨床需求。因此，開展重組尿酸酶大規(guī)模生產(chǎn)工藝研究就顯得很有必要。

基因工程技術(shù)是解決診斷試劑盒工具酶原酶來源的有效技術(shù)方法之一，它不但能大大降低生產(chǎn)成本，而且也容易消除目的酶中的干擾酶。作者所在課題組曾報道了各種因素對搖瓶中重組酵母尿酸酶工程菌影響的研究成果[8]。在已有工作的基礎(chǔ)上，作者主要考察了在300 L的發(fā)酵罐中工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)及其酶的大規(guī)模制備工藝路線的建立。

1 材料與方法

1.1 主要材料

表達(dá)重組尿酸酶基因工程菌，由作者所在研究室構(gòu)建；硫酸卡那霉素（Kanamycin Sulfate），購自Merck公司；丙烯酰胺（acrylamide，Acr），N，N’-甲叉雙丙烯酰胺 （methylene bisacrylamide，Bis），SDS，購自Bio-Rad公司；低相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（low molecular weight calibration kit，LMW calibration kit）和Q-Spharose F.F.，購自Pharmacia公司；蛋白胨（Tryptone）和酵母粉 （Yeast Extract），購自英國OXOID公司；尿酸，購自Sigma公司；其它試劑均為國產(chǎn)A.R級。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基（LB）硫酸卡那霉素（Kanamycin Sulfate）50 μg/mL，蛋白胨（Tryptone）10 g/L，酵母浸膏（Yeast Extract）5 g/L，NaCl 10 g/L。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨（Tryptone）10 g/L，酵母浸膏 （Yeast Extract）5 g/L，NaCl 10 g/L， 甘油（Glycerol）4 g/L，K2HPO412 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，乳糖（Lactose）400 g/L。

1.3 主要儀器

工作體積300 L發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司制造；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf 5804R、Beckman Avanti J-20XP），分別由德國艾本德（中國）生命科學(xué)公司和美國貝克曼庫爾特（中國）有限公司提供；紫外可見分光光度計（UnicoTMUC-2102 PC），尤尼柯（上海）儀器有限公司提供；VCX-750型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，Sonics公司制造；Power PAC300型電泳系統(tǒng)，76S/02324型凝膠成像分析儀，Bio-Rad公司提供；GQ75B高速管式離心機(jī)，上海浦東天本離心機(jī)機(jī)械有限公司制造；GYB300-10S高壓均質(zhì)機(jī)，上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠制造；721型分光光度計，上海第三分析儀器廠制造；冷卻罐，溫州市商泰輕工機(jī)械有限公司制造；Mini Pellicon及Pellicon超濾系統(tǒng)，Millipore公司提供。

1.4 種子培養(yǎng)基選擇

取凍存的工程菌，接種于含1 g/dL瓊脂的種子培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)10～12 h，活化2～3次。挑取生長飽滿的單菌落于搖瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，37℃，200 r/min培養(yǎng)10～12 h，期間取少許菌液采用SDSPAGE分析其目的蛋白質(zhì)的表達(dá)量。取上述菌液按體積分?jǐn)?shù)5%接種量在同樣條件下培養(yǎng)10～12 h，OD600為5.0時，即為發(fā)酵罐培養(yǎng)用工程菌種子液。

1.5 重組尿酸酶（r-UO）發(fā)酵表達(dá)

將工程菌種子液以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量轉(zhuǎn)入到含270 L培養(yǎng)液的300 L的發(fā)酵罐中，200 r/min攪拌培養(yǎng)，通氣量調(diào)節(jié)至使溶解氧大于30%飽和度，37℃條件下間隔2小時定時取樣。分析檢測生物量（OD600）、菌體濕質(zhì)量、pH。待菌株生長到對數(shù)生長期時加入誘導(dǎo)劑培養(yǎng)。

1.6 誘導(dǎo)培養(yǎng)

在菌體進(jìn)入對數(shù)生長末期，加入乳糖溶液于發(fā)酵罐中，終質(zhì)量濃度為5 g/L，開始誘導(dǎo)培養(yǎng)。間隔2 h定時取樣，檢測分析OD600、菌體濕質(zhì)量、pH及酶活性。若酶活性不再增長或下降即停止發(fā)酵。將發(fā)酵液泵入貯存罐，冷卻降溫至10℃時，泵入連續(xù)離心筒離心。收集的菌體稱質(zhì)量，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 蛋白質(zhì)含量和酶活力測定方法

蛋白質(zhì)含量測定參照Bradford法[9]進(jìn)行，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)對照；酶活定義及測定方法按參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。

1.8 生物量分析

生物量的測定采用細(xì)菌光電比濁計數(shù)法，用分光光度計測其OD600值表示菌體濃度。

1.9 無細(xì)胞粗酶液的制備

按1 kg菌體與20倍 50 mmol/L pH 8.5 Tris-HCl緩沖液懸浮菌體，于冷卻罐預(yù)冷至2～4℃，泵入高壓均質(zhì)機(jī)（壓力50 MPa），循環(huán)重復(fù)2次至破碎完全，然后泵入高速管式離心機(jī)，16 000 g連續(xù)離心，收集上清液。上清液放在預(yù)冷的冷凍罐中，在電動攪拌下加入硫酸銨，至飽和度達(dá)40%，靜置1～2 h，泵入高速管式離心機(jī)，16 000 g連續(xù)離心，棄沉淀后保留上清液。在上清液中追加硫酸銨達(dá)60%飽和度，再次泵入高速管式離心機(jī)，16 000 g連續(xù)離心后收集沉淀。將沉淀溶解于5 L 50 mmol/L pH 8.5的Tris-HCl緩沖液中，進(jìn)行簡單離心后用Pellicon超濾系統(tǒng)超濾除鹽。

1.10 Q-Sepharose Fast Flow層析

粗酶液經(jīng)0.45～0.6 μm濾膜過濾脫鹽后上經(jīng)20 mmol/L pH 8.5 Tris-HCl緩沖液充分平衡的QSepharose F.F層析柱（5 cm×30 cm）。上樣畢，用相同緩沖液洗滌至280 nm吸收值達(dá)記錄紙基線，然后以0～0.2 mol/L NaCl緩沖液梯度洗脫，通過酶活性檢測方法及紫外檢測280 nm吸收峰情況，用部分收集器收集活性峰部分，之后適當(dāng)超濾濃縮、記錄體積、留樣測定酶活和蛋白質(zhì)含量，并進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%SDS-PAGE分析。

1.11 SDS-PAGE

[11]所述方法進(jìn)行。濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.0%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%。樣品在濃縮膠中的電壓為120 V，分離膠中電壓160 V。膠條用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 工程菌發(fā)酵罐菌體生長曲線

如圖1所示，工程菌在發(fā)酵罐中培養(yǎng)1.5 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，5 h后進(jìn)入對數(shù)生長末期，加誘導(dǎo)劑乳糖之后的1 h菌體生長出現(xiàn)停滯，6.5 h后菌體又開始生長，約11 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，13.5 h后生物量與酶活性出現(xiàn)微降。從該曲線可知，5 h為菌體生長的對數(shù)中后期，即誘導(dǎo)的最佳時機(jī)。乳糖誘導(dǎo)生長6 h后，生物量和酶活性趨于穩(wěn)定，8 h后生物量與酶活性出現(xiàn)微降，故誘導(dǎo)時間約7 h為最佳。

圖1 重組尿酸酶的發(fā)酵罐生長曲線Fig.1 Growth curve of recombinant Urate Oxidase in fermenter

2.2 重組尿酸酶的分離純化

菌細(xì)胞懸液經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)破碎后，離心獲得上清液。首先采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%～60%硫酸銨分級沉淀，初級分離；然后用Q-Sepharose F.F層析柱進(jìn)一步純化（見圖2）。

圖2 重組尿酸酶Q-Spharose F.F層析圖譜Fig.2 Q-Spharose FF chromatography of recombinant uricase

不同純化階段樣品液的SDS-PAGE分析結(jié)果如圖3所示。酶活性和電泳結(jié)果顯示，兩個洗脫峰均為目的蛋白質(zhì)峰，其中第1個洗脫峰目的蛋白質(zhì)純度高，第2個峰含有一些雜蛋白質(zhì)。整個純化結(jié)果見表1，最終獲得該酶的純化倍數(shù)達(dá)4.56倍，活性回收率為40%。

2.3 重組尿酸酶的鑒定

純化的重組尿酸酶經(jīng)SDS-PAGE（見圖4）檢測，結(jié)果顯示單一蛋白質(zhì)色帶；經(jīng)HPLC（見圖5）檢測，結(jié)果顯示單一洗脫峰。經(jīng)SDS-PAGE分析計算，該酶的表觀分子量為34 kDa，經(jīng)HPLC（見圖5和圖6）分析，計算求得該酶分子量為130 kDa，屬四聚體。

表1 重組尿酸酶純化過程總結(jié)Table 1 Purification procedure of recombinant uricase

圖3 重組尿酸酶不同純化階段的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant uricase purified from various steps

圖4 重組尿酸酶純品還原/非還原SDS-PAGEFig.4 Reduced/Non-reduced SDS-PAGE of purified ruricase

圖5 重組尿酸酶及標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的HPLC洗脫圖譜Fig.5 Elution chromatogram of r-uricase and standard proteins on HPLC

圖6 HPLC中標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Ve/Vo和相對分子質(zhì)量關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of standard proteins on HPLC with relationship between Ve/Voand molecular weight

3 討論

尿酸酶廣泛存在于動物、植物、真菌、酵母和細(xì)菌中，能以分子氧作為受體催化尿酸氧化生成尿囊素、CO2和H2O2。如果人體內(nèi)由于膳食等原因產(chǎn)生過量的尿酸或排泄受阻，就會導(dǎo)致體內(nèi)嘌呤代謝紊亂，引起血液中尿酸沉積形成高尿酸血癥。另一方面，對于某些敏感個體，食用富含嘌呤的食物如動物肝臟、魚類、果酒等亦會引起痛風(fēng)等疾病。因此，在臨床上尿酸酶就可以作為治療痛風(fēng)、高尿酸血癥等的藥物。尿酸酶作為以上疾病診斷的關(guān)鍵工具酶，具有可靠性好、反應(yīng)靈敏、特異性高、干擾因素少等優(yōu)點，已成為檢測血液尿酸的最佳方法。但目前，國內(nèi)由于酶制劑質(zhì)量等原因主要依賴于進(jìn)口。

4 結(jié)語

利用 PET-Urate Oxidase表達(dá)轉(zhuǎn)化 E.coli JM109（DE3）構(gòu)建的尿酸酶基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，根據(jù)發(fā)酵罐生長曲線對其分離純化條件優(yōu)化，確定發(fā)酵5 h為菌體生長對數(shù)中后期即誘導(dǎo)最佳時機(jī)；同時確定誘導(dǎo)約7 h最佳。目前重組尿酸酶都由IPTG作為誘導(dǎo)劑，價格高和潛在毒性限制了其應(yīng)用。乳糖作為廉價二糖，可使攜帶pET表達(dá)質(zhì)粒的E.coli JM109（DE3）的lac啟動子表達(dá)T7 mRNA聚合酶，利用該酶誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，成功實現(xiàn)了重組尿酸酶大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)。經(jīng)過Q-Sepharose F.F層析柱分離純化和鑒定，確定其目的洗脫蛋白質(zhì)即為重組尿酸酶，計算證實該酶為四聚體。

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Study on Fermentation and Preparation of Recombinant Uricase

ZHAO Ming1， HE Zhongjie1， WANG Rui1， YAO Mingdong1， SHI Hui2， WANG Zhenwei2， MENG Yao*1
（1.School of Medical Laboratory Science，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China；2.School of Life Science/Key Laboratory of China Ministry Education for Bio-resources and Eco-environment，Sichuan University，Chengdu 610064，China）

This manuscript was applied with recombinant plasmid PET-urate oxidase gene expressed from E.coli JM109（DE3）to study the conditions of fermentation and purification of recombinant urate oxidase.The freezing stored engineering bacteria were inoculated to seed culture medium which contained 1%agar for slant cultivation.We used lactose as inducer and fermentation was conducted in 300 L fermenter.Finally，2 700 g wet samples（1 200 U/g）were prepared and the aimed protein expression was about 30%proportions to soluble bacteria.After crushed by highpressure quality machine，the ammonium sulphate precipitation from 40%to 60%saturation and QSepharose FF ion-exchange chromatography，the purity of the obtained r-Urate Oxidase was up to 97% and 40% of final yield，as well as 30 U/mg of the specific activity.Additionally，theinterference enzyme of catalase was also under standard conditions.The purified enzyme can be stored one year at 4℃ under sterile procedure and the activity can retain about 85%.The lyophilized powder can also be stored for one year and the activity have not been released.All results of this study could lay the theoretical foundation in medical application.

recombinant uricase，lactose，inducible expression，fermentation，purification

Q 55

A

1673—1689（2015）03—0311—05

2014-03-25

四川省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201313705020）；成都醫(yī)學(xué)院創(chuàng)新性實驗項目（CS201228）；成都醫(yī)學(xué)院實驗室開放項目（Kf201407）。

*通信作者：孟 堯（1981—），男，甘肅蘭州人，理學(xué)博士，副教授，主要從事蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與工程研究。E-mail：myaopapers@gmail.com