羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的提取及其性質(zhì)

葉 韜， 林 琳， 張曉霞， 姜紹通， 陸劍鋒

（合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥230009）

羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的提取及其性質(zhì)

葉 韜， 林 琳， 張曉霞， 姜紹通， 陸劍鋒*

（合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥230009）

為充分利用魚片加工廢棄物魚骨中的膠原蛋白質(zhì)，采用單因素以及正交實(shí)驗(yàn)法，研究胃蛋白酶在酸性介質(zhì)條件下提取羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的最佳工藝，精制后的膠原蛋白質(zhì)采用SDSPAGE電泳、紫外及傅立葉變換紅外掃描，圓二色檢測(cè)，氨基酸分析，熱變性溫度測(cè)定等方法，分析膠原蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。結(jié)果顯示：乳酸溶液pH 2.6，溫度30℃，料液比1∶30（g/mL），加酶量200 U/g，提取時(shí)間24 h，此工藝條件下的粗膠原蛋白質(zhì)提取率達(dá)到70.28%，得率為12.76%；羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)含有2條α鏈和1條β鏈，屬于典型的I型膠原蛋白質(zhì)；羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的主要氨基酸為甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、谷氨酸和丙氨酸；羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的熱變性溫度為34.5℃。研究表明，采用胃蛋白酶提取魚骨膠原蛋白質(zhì)，提取率和純度均較高。

羅非魚骨；膠原蛋白質(zhì)；理化性質(zhì)

Keywords：Tilapia bone，collagen，physicochemical property

羅非魚是目前我國(guó)出口創(chuàng)匯的優(yōu)勢(shì)養(yǎng)殖品種，2012年養(yǎng)殖產(chǎn)量約為145萬t，出口產(chǎn)品以凍魚片為主。在加工魚片的過程中，產(chǎn)生大量低商業(yè)價(jià)值的下腳料，其中大部分是魚骨，而魚骨蛋白質(zhì)含量豐富，且主要為膠原蛋白質(zhì)，因此大量的下腳料蘊(yùn)含著巨大的膠原蛋白質(zhì)資源[1]。

膠原蛋白質(zhì)是動(dòng)物體內(nèi)含量最多的一類蛋白質(zhì)，占機(jī)體總蛋白質(zhì)含量的30%左右，它在醫(yī)療保健、食品工業(yè)、美容與化妝品、新型生物材料等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[2]。傳統(tǒng)工業(yè)上的膠原蛋白質(zhì)來源主要為牛羊的皮和骨，但由于畜傳染病，宗教信仰等原因，致使水產(chǎn)動(dòng)物膠原蛋白質(zhì)的安全性和適用人群范圍均優(yōu)于傳統(tǒng)來源的牲畜類膠原蛋白質(zhì)[3]。此外，從水產(chǎn)品加工廢棄物中提取膠原蛋白質(zhì)，不僅有助于降低加工成本，增加產(chǎn)品的附加值，而且可以減少環(huán)境污染。

Zeng等[4]采用乙酸提取羅非魚皮膠原蛋白質(zhì)，研究了膠原蛋白質(zhì)的氨基酸含量、紫外吸收特性、變性溫度及溶解性等理化性質(zhì)；曾少葵等[5]用胃蛋白酶從羅非魚鱗中提取膠原蛋白質(zhì)，并對(duì)酶解產(chǎn)物的抗氧化性進(jìn)行研究，表明酶解產(chǎn)物具有良好的抗氧化效果；段宙位等[6]以羅非魚尾為原料，研究魚尾脂溶性色素的去除方法及膠原蛋白質(zhì)的提取工藝，測(cè)定膠原蛋白質(zhì)的純度為84.61%，并通過紫外吸收光譜和蛋白電泳初步鑒定為Ⅰ型膠原蛋白質(zhì)。然而，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的研究報(bào)道較少。鑒于此，本文作者對(duì)羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，為今后綜合開發(fā)利用羅非魚片加工副產(chǎn)物提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚骨，取自廣東明基水產(chǎn)品有限公司；胃蛋白酶（1∶3 000，活力為5 346 U/g），購(gòu)于上海源聚生物科技有限公司；檸檬酸、乳酸、乙酸和濃鹽酸等，均為分析純，購(gòu)于合肥美豐化工儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722E型可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司制造；DHG-9123J精密恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司制造；FD-1B-50型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司制造；TU-1901型雙光束紫外分光光度計(jì)，北京普析通用器有限公司制造；Nicolet 67型傅里葉紅外光譜儀，美國(guó)Thermo Nicolet公司制造；L-8800型氨基酸分析儀，日本日立公司制造；DYY-11型電泳儀，北京六一儀器廠制造；VP-DSC微量差示掃描量熱儀，美國(guó)MICROCAL公司制造；J-810圓二色光譜儀，日本JASCO公司制造。

1.3 羅非魚骨基本營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

水分，參照GB 5009.3-2010《食品中水分的測(cè)定》中的直接干燥法進(jìn)行測(cè)定；灰分，參照GB 5009.4-2010《食品中灰分的測(cè)定》中的灼燒稱重法進(jìn)行測(cè)定；粗蛋白質(zhì)，參照GB 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法測(cè)定；粗脂肪，參照GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測(cè)定》中的索氏抽提法測(cè)定。

1.4 膠原蛋白質(zhì)提取原料的制備

1.4.1 工藝流程羅非魚骨→粉碎→脫脂→脫礦物質(zhì)→脫雜蛋白質(zhì)→脫雜魚骨

1.4.2 工藝說明脫脂：在粉碎的魚骨中加入30倍的體積分?jǐn)?shù)10%的異丙醇，浸泡24 h，過濾，蒸餾水洗凈；脫礦物質(zhì)：15℃條件下，加入8倍0.5 mol/L的鹽酸，浸泡1 h，重復(fù)3次，蒸餾水洗凈；脫雜蛋白質(zhì)：先用 NaOH（0.1 mol/L）溶液浸泡6 h，過濾，蒸餾水洗凈，再用30倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%NaCl溶液浸泡6 h，蒸餾水洗凈。詳見文獻(xiàn)[7]。

1.5 膠原蛋白質(zhì)提取工藝與純化

1.5.1 工藝流程脫雜魚骨→調(diào)節(jié)料液比→加酶控溫酶解→離心→取上清液→粗提的膠原蛋白質(zhì)→鹽析→透析→冷凍干燥→精制的膠原蛋白質(zhì)。

1.5.2 工藝說明鹽析：取上清液加NaCl至其終濃度為 0.9 mol/L，4℃鹽析過夜，鹽析后4℃下6 000 r/min離心20 min，沉淀用0.5 mol/L乙酸溶解，重復(fù)操作1次；透析：將鹽析后的蛋白質(zhì)液移入透析袋，用蒸餾水透析3 d，每天更換透析水3次，最后真空冷凍干燥[8]。

1.6 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用0.001 mol/L鹽酸將L-羥脯氨酸分別配制成2、4、6、8 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液；取1 mL標(biāo)準(zhǔn)液，經(jīng)過氯胺T和高氯酸氧化，生成含有吡咯環(huán)的氧化物，與對(duì)二甲基氨基苯甲醛進(jìn)行顯色反應(yīng)，以濃度0.001 mol/L鹽酸為空白，測(cè)定在560 nm處的吸光度。取吸光值為縱坐標(biāo)，L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。經(jīng)計(jì)算得到回歸方程y=0.068x-0.001；變異系數(shù)R2=0.998。

圖1 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of L-hydroxyproline

1.7 膠原蛋白質(zhì)含量及提取率的測(cè)定

參照陸劍鋒等[8]的方法。取15 mg羅非魚骨至安瓿瓶中，加入6 mol/L的鹽酸溶液1 mL，用酒精噴燈封口，于130℃下消化3 h；水解液定容至50 mL，并取稀釋后的水解液1 mL，按羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線法，將吸光度值由回歸方程進(jìn)行換算，可得羥脯氨酸含量，再乘以換算系數(shù)11.1，即可得膠原蛋白質(zhì)的含量。

式（1）中：W為粗膠原蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，ρ為羥脯氨酸質(zhì)量濃度，n為稀釋倍數(shù)，m為魚骨質(zhì)量。

取0.5 mL膠原蛋白質(zhì)提取液，按照粗膠原蛋白質(zhì)含量測(cè)定的方法測(cè)定其膠原蛋白質(zhì)含量。

式（2）中：r為膠原蛋白質(zhì)提取率，ρ為羥脯氨酸質(zhì)量濃度，n為稀釋倍數(shù)，w為脫雜羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.8 膠原蛋白質(zhì)的SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)定

參照Senaratne等[9]的方法。樣品處理：取0.5 g精制的膠原蛋白質(zhì)，加入4.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的SDS溶液，于85℃水浴鍋內(nèi)加熱1 h，充分溶出蛋白質(zhì)，冷卻后于10 000 r/min離心10 min，上清液與SDS緩沖液按體積比1∶1混合，置沸水浴煮沸5 min，冷卻后分別稀釋2倍和5倍進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL；電泳：用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%分離膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%濃縮膠，電壓100 V，待指示劑距凝膠底部3～5 mm左右停止電泳。用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色10 min，脫色液脫色至條帶清晰，并拍照。

1.9 膠原蛋白質(zhì)的紫外（UV）光譜掃描

用0.5 mol/L乙酸溶解適量冷凍干燥后的羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)，配制成約為0.5 mg/mL的膠原蛋白質(zhì)溶液，并用0.5 mol/L乙酸溶液作為參照，在190～360 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行吸收波譜掃描，分辨率為1 nm。

1.10 膠原蛋白質(zhì)的傅立葉變換紅外（FT-IR）掃描

稱取冷凍干燥后的純化樣品約1 mg，與一定量干燥好的KBr混合置于瑪瑙研缽中，研磨成細(xì)微粉末狀后裝樣，手動(dòng)壓片，采用傅立葉變換紅外掃描儀在400～4 000 cm-1區(qū)間內(nèi)進(jìn)行吸收波譜掃描。

1.11 膠原蛋白質(zhì)的熱變性溫度測(cè)定

用0.5 mol/L乙酸溶解適量冷凍干燥后的羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)，配制成約3 mg/mL的膠原蛋白質(zhì)溶液，并以0.5 mol/L乙酸作為參比，放入VP-DSC微量差示掃描量熱儀中，加熱溫度為5～60℃，升溫速率1℃/min。

1.12 膠原蛋白質(zhì)的圓二色性測(cè)定

用0.5 mol/L乙酸溶解適量冷凍干燥后的羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)，配制成10 mg/mL的膠原蛋白質(zhì)溶液，比色皿光徑為1 mm，分辨率1.0 nm，掃描速率100 nm/min，掃描5次，測(cè)定190～230 nm的圓二色光譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚骨基本營(yíng)養(yǎng)成分

由表1可知，羅非魚骨的粗蛋白質(zhì)含量豐富，質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為23%，高于鮰魚骨中 （質(zhì)量分?jǐn)?shù)19.4%）以及鰱魚骨中（質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.9%）的[10]，因此有必要充分開發(fā)利用羅非魚的魚骨蛋白質(zhì)資源。此外，灰分含量也較高，表明骨鈣等礦質(zhì)元素較多，今后可以考慮進(jìn)一步綜合開發(fā)利用。

2.2 魚骨及脫雜魚骨的膠原蛋白質(zhì)含量

經(jīng)測(cè)定，羅非魚骨的初始總膠原蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.3%，約占粗蛋白質(zhì)總量的80%；而脫雜后的羅非魚骨其膠原蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.4%。葉小燕等[11]和張穎潔[12]的研究表明，羅非魚皮和魚鱗的膠原蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為27.8%和26.3%。由此可見，羅非魚骨的膠原蛋白質(zhì)含量較高，僅次于羅非魚皮和魚鱗中膠原蛋白質(zhì)含量。

表1 羅非魚骨的基本營(yíng)養(yǎng)成分（以濕基計(jì)）Table 1 Content of basic nutrition in tilapia bone（on wet basis）±SD

表1 羅非魚骨的基本營(yíng)養(yǎng)成分（以濕基計(jì)）Table 1 Content of basic nutrition in tilapia bone（on wet basis）±SD

基本營(yíng)養(yǎng)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%水分18.56±1.88灰分54.68±2.15粗蛋白質(zhì)22.99±0.49粗脂肪2.72±0.05

2.3 膠原蛋白質(zhì)提取介質(zhì)的選取

在料液比為1∶30（g/mL），加酶量為200 U/g，30℃條件下，使用檸檬酸、乳酸、乙酸為介質(zhì)，在pH值分別為1.7、2.0、2.3、2.6、2.9和3.2時(shí)提取12 h，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同pH條件下采用檸檬酸、乳酸和乙酸為介質(zhì)的膠原蛋白質(zhì)提取率Fig.2 Extraction yield of collagen with different pH conditions by using citric acid，lactic acid and acetic acid as medium

由圖2可知，不同種類的酸介質(zhì)，在相同的pH值條件下，對(duì)羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的提取效果不同。其中，選擇pH值為2.6的乳酸為介質(zhì)時(shí)，膠原蛋白質(zhì)的提取率最高，其次是pH值為2的乙酸介質(zhì)，而檸檬酸的提取率最低。這可能是由于氫離子的質(zhì)子化作用使得膠原蛋白質(zhì)在酸溶液中易充分溶脹，但相比于醋酸和檸檬酸，乳酸溶液在pH為2.6時(shí)含有更多能形成氫鍵作用的基團(tuán)，從而提高了膠原蛋白質(zhì)在乳酸溶液中的溶解度[13]。同時(shí)考慮到無水乙酸在常溫下具有強(qiáng)烈的刺激性氣味，且低溫時(shí)也易形成冰狀結(jié)晶析出（熔點(diǎn)16.6℃），不利于后續(xù)的試驗(yàn)操作[14]，因此本試驗(yàn)中選取乳酸為提取介質(zhì)。

2.4 膠原蛋白質(zhì)提取溫度的確定

以pH 2.6的乳酸為提取介質(zhì)，料液比1∶40（g/ mL），加酶量為200 U/g，提取12 h，考察不同溫度對(duì)提取率的影響。由圖3可知，在10～30℃范圍內(nèi)，提取溫度越高，酶促反應(yīng)越快，膠原蛋白質(zhì)的提取率隨溫度的升高而增大，這與程波等[15]用胃蛋白酶提取鱘魚皮和刁雪洋[16]用木瓜蛋白酶提取豬皮膠原蛋白質(zhì)時(shí)得到的結(jié)論一致。此外，Potaros等[17]的研究表明，采用胃蛋白酶在22℃和4℃條件下提取羅非魚皮膠原蛋白質(zhì)，得到的膠原蛋白質(zhì)在氨基酸含量、熱變性溫度以及相對(duì)分子質(zhì)量方面均無顯著性差異。根據(jù)本試驗(yàn)的結(jié)果，同時(shí)考慮到過高的溫度可能會(huì)引起膠原蛋白質(zhì)變性，需將提取溫度控制在變性溫度以下，因此本試驗(yàn)中選取的提取溫度為30℃。

圖3 溫度對(duì)膠原蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of different temperature on extraction rate of collagen

2.5 膠原蛋白質(zhì)提取料液比的確定

以pH 2.6的乳酸為提取介質(zhì)，加酶量為200 U/ g，30℃條件下，提取時(shí)間為12 h，考察不同料液比對(duì)提取率的影響。由圖4可知，提取率隨底物濃度的減小而增大，當(dāng)?shù)孜餄舛葴p小到一定程度時(shí)，提取率趨于平穩(wěn)。段宙位等[6]利用胃蛋白酶法提取羅非魚尾膠原蛋白質(zhì)，料液比達(dá)到一定程度時(shí)，膠原蛋白質(zhì)溶出基本達(dá)到平衡，提取率增加的幅度不大，這與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。當(dāng)?shù)孜餄舛冗^大時(shí)，酶促反應(yīng)被抑制，而當(dāng)?shù)孜锉环稚⒌揭欢ǔ潭葧r(shí)，反應(yīng)達(dá)到平衡，因此本試驗(yàn)中選取料液比為1∶40（g/ mL）進(jìn)行正交優(yōu)化。

2.6 膠原蛋白質(zhì)提取加酶量的確定

胃蛋白酶只對(duì)膠原蛋白質(zhì)的非螺旋末端的分子交聯(lián)區(qū)域起作用，不會(huì)破壞三股螺旋結(jié)構(gòu)，采用胃蛋白酶制備膠原蛋白質(zhì)是有效的方法[18]。以pH為2.6的乳酸為提取介質(zhì)，料液比為1∶40（g/mL），加酶量為200 U/g，30℃條件下提取12 h，考察不同加酶量對(duì)提取率的影響。由圖5可知，隨著加酶量的增加，提取率先升高后降低，在200 U/g時(shí)到達(dá)最大值。該結(jié)果表明，此時(shí)反應(yīng)體系中的酶活力可能處于最大，酶與底物恰好能夠完全反應(yīng)，如果繼續(xù)添加酶量則反而會(huì)起到阻礙作用，抑制酶解反應(yīng)的進(jìn)行[19]。因此本試驗(yàn)中選取的加酶量為200 U/g。

圖4 不同料液比對(duì)膠原蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of different solid-liquid ratio on extraction rate of collagen

圖5 不同加酶量對(duì)膠原蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5 Effect of different enzyme dosage on extraction rate of collagen

2.7 膠原蛋白質(zhì)提取時(shí)間的確定

以pH 2.6的乳酸為提取介質(zhì)，料液比1∶40（g/ mL），加酶量為200 U/g，30℃條件下考察提取時(shí)間對(duì)提取率的影響。由圖6可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率不斷升高，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到21 h時(shí)左右，增幅明顯減小，因此本試驗(yàn)中選取提取時(shí)間21 h進(jìn)行正交優(yōu)化。

2.8 酶水解條件的正交優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇料液比（A）、提取時(shí)間（B）與加酶量（C）作為試驗(yàn)因子，以膠原蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見表2，不同因素水平組合的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果見表3。

圖6 提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.6 Effect of extraction duration on extraction rate of collagen

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 2 Orthogonal design of experiment

表3 L9（34）正交分析Table 3 L9（34）analysis

由極差分析結(jié)果可知，影響羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)提取率的主次因素為B>C>A（較顯著的因素是提取時(shí)間，其次為酶添加量，料液比不顯著），最佳因素水平的組合為B3C2A3，即提取時(shí)間24 h，加酶量200 U/g，料液比1∶50（g/mL）。鑒于料液比對(duì)羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)提取率的影響不顯著，進(jìn)一步選取料液比為1∶30（g/mL），酶添加量200 U/g，提取時(shí)間24 h，此時(shí)提取率達(dá)到70.28%，相對(duì)誤差僅為2.77%。從節(jié)約成本考慮，最后選擇料液比1∶30（g/mL）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。此條件下，相對(duì)于原料魚骨的初始質(zhì)量而言，羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的最終得率為12.76%。

2.9 紫外掃描圖譜

膠原蛋白質(zhì)肽鏈所含的C=O、—COOH、CONH2都是生色基團(tuán)，分子中的價(jià)電子吸收能量發(fā)生躍遷，可在220 nm附近產(chǎn)生較強(qiáng)的紫外吸收。大多數(shù)蛋白質(zhì)由于含有一定量的色氨酸，因而在280 nm處具有較強(qiáng)的紫外吸收，但是膠原蛋白質(zhì)幾乎不含色氨基酸，所以在280 nm處無明顯吸收[4]。羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜如圖7所示，羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)在220～240 nm處有較強(qiáng)吸收峰，在228 nm處有最大吸收峰，而在280 nm處沒有顯著吸收峰，符合膠原蛋白質(zhì)的紫外吸收特征。Duan等[20]報(bào)道了鯉魚骨膠原蛋白質(zhì)在223 nm處有最大吸收峰，與羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)略有差異，可能是由于不同動(dòng)物膠原蛋白質(zhì)的氨基酸種類和含量不同導(dǎo)致。

圖7 羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的紫外掃描圖譜Fig.7 UV scanning spectra of collagen from tilapia bone

2.10 氨基酸組成分析

膠原蛋白質(zhì)較其他蛋白質(zhì)的氨基酸組成有一個(gè)明顯的特征，即含有大量的甘氨酸以及豐富的亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）等[14]。由表4可知，在羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)中，甘氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，占22.85%；其次是亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸），占21.47%；谷氨酸和丙氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)也較高，分別占9.77%和9.46%；幾乎不含或僅含少量的苯丙氨酸和半胱氨酸。

2.11 SDS-PAGE凝膠電泳

由圖8可知，用胃蛋白酶經(jīng)乳酸介質(zhì)提取的羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)含3條鏈，即α1、α2和β，表明提取的膠原蛋白質(zhì)屬于典型的Ⅰ型膠原蛋白質(zhì)[21]。α1鏈的相對(duì)分子質(zhì)量約為120 kD，α2鏈的相對(duì)分子質(zhì)量在100～120 kD之間，β鏈的相對(duì)分子質(zhì)量略大于200 kD。α1鏈的含量最高，其次是α2鏈，而β鏈含量最低。此外，無論是高濃度樣品（泳道2），還是稀釋后的樣品（泳道3和4），電泳圖譜中幾乎不含雜帶，可見所提膠原蛋白質(zhì)純度較高。

表4 羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of collagen from tilapia bone

圖8 羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的電泳圖譜Fig.8 SDS-PAGE pattern of collagen from tilapia bone

2.12紅外掃描圖譜

酰胺A帶主要是由N—H伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的，吸收峰出現(xiàn)在3 400～3 440 cm-1，但它與氫鍵締合后，將向低波數(shù)發(fā)生位移；酰胺B是由CH2的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的；酰胺Ⅰ帶是由蛋白多肽骨架的C=O伸縮振動(dòng)引起，特征吸收頻率位于1 600～1 700 cm-1之間，為蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的敏感區(qū)域，且其吸收最強(qiáng)，常被用于蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；酰胺Ⅱ帶由C—N伸縮振動(dòng)與N—H彎曲振動(dòng)產(chǎn)生，其特征吸收頻率為1 500～1 600 cm-1，是膠原蛋白肽鏈α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲疊加，以及精氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸側(cè)鏈的吸收帶；酰胺Ⅲ帶是由C—N伸縮振動(dòng)和N—H彎曲振動(dòng)形成的，特征吸收范圍為 1 200～1 360 cm-1，屬于甘氨酸骨架和脯氨酸側(cè)鏈的CH2搖擺振動(dòng)峰，是膠原蛋白質(zhì)不同于其它蛋白質(zhì)的特征吸收峰[22]。羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的傅立葉變換紅外掃描（FT-IR）圖譜如圖9所示，酰胺A出現(xiàn)在3 324 cm-1處，表明N—H伸縮振動(dòng)與氫鍵形成了締合體，2 923 cm-1處的吸收是由酰胺B帶的C—N伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的，酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶分別出現(xiàn)在 1 652、1 544 cm-1和1 234 cm-1，均符合膠原蛋白質(zhì)的特征吸收峰。這與Sigma I型標(biāo)準(zhǔn)膠原蛋白質(zhì)[23]具有較高的相似度。

圖9 羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的傅立葉紅外轉(zhuǎn)換掃描圖譜Fig.9 Fourier transform infrared spectrum of collagen from tilapia bone

2.13 膠原蛋白質(zhì)的熱變性溫度的測(cè)定

圖10為羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的差示量熱掃描（DSC）圖譜。由圖10可知，羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的變性溫度為34.5℃，高于變性溫度為30.0℃的鯉魚骨酶溶性膠原蛋白質(zhì)[24]。Pati等[25]的研究認(rèn)為，水產(chǎn)動(dòng)物膠原的熱變性溫度不僅與棲息環(huán)境的溫度有關(guān)，還與膠原蛋白質(zhì)的亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）含量有關(guān)，因?yàn)閬啺被岬倪量┉h(huán)和羥脯氨酸的羥基所形成的氫鍵對(duì)膠原結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起著重要作用。Ikoma等[26]的研究表明，真鯛、羅非魚的Ⅰ型魚鱗膠原蛋白質(zhì)的熱變性溫度與羥脯氨酸的含量之間呈良好的線性關(guān)系。而羅非魚屬于熱帶魚類，抗凍能力差，其棲息水溫不僅高于鯉魚，而且其骨膠原蛋白質(zhì)中的亞氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（21.47%）也高于鯉魚骨膠原蛋白質(zhì)的（20.4%），推測(cè)這可能是羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的變性溫度高于鯉魚骨膠原蛋白質(zhì)的變性溫度所致。

圖10 羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的熱變性溫度圖譜Fig.10 DSC spectrum of collagen from tilapia bone

2.14 膠原蛋白質(zhì)的圓二色光譜

羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)在遠(yuǎn)紫外區(qū)的圓二色譜圖見圖11。圓二色光譜分析（Circular dichroism簡(jiǎn)稱CD）是研究稀溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種快速、簡(jiǎn)單、較準(zhǔn)確的方法[27]。由圖11可知，羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)在198 nm處有一負(fù)峰，在222 nm處有一正峰，表明提取的膠原蛋白質(zhì)具有完整的3股螺旋結(jié)構(gòu)，這也符合Ⅰ型膠原蛋白質(zhì)的典型特征[26]。

圖11 羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的圓二色圖譜Fig.11 CD spectrum of collagen from tilapia bone

3 結(jié)語

1）胃蛋白酶提取脫雜羅非魚骨中膠原蛋白質(zhì)的最佳工藝條件為：選擇pH 2.6的乳酸為提取介質(zhì)，在溫度30℃下，調(diào)整料液比為1∶30（g/mL），加酶量200 U/g，提取時(shí)間24 h，此時(shí)粗膠原蛋白質(zhì)提取率可以達(dá)到70.28%，而相對(duì)于原料魚骨初始質(zhì)量的得率為12.76%。

2）羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的酸溶液在228 nm處有最大紫外吸收峰，蛋白質(zhì)電泳、紅外光譜掃描和圓二色光譜結(jié)果均表明其結(jié)構(gòu)符合Ⅰ型膠原蛋白質(zhì)的典型結(jié)構(gòu)特征，即由3條肽鏈（α1，α2和β）組成的3股螺旋結(jié)構(gòu)。

3）羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的主要氨基酸為甘氨酸和亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸），其次為谷氨酸和丙氨酸，其蛋白質(zhì)變性溫度為34.5℃。

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Extraction and Characterization of Collagen from Tilapia Bone

YE Tao， LIN Lin， ZHANG Xiaoxia， JIANG Shaotong， LU Jianfeng*
（College of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China）

Fish bone，containing plenty of collagen，is the main offal from fish fillet processing.The collagen from Tilapia bone after removing impurities was extracted by pepsin digestion in acid medium condition.The effects of extraction medium，temperature，material to liquid ratio，pepsin addition，extraction duration on yield of collagen were investigated.The optimum conditions using lactic acid as medium to extract collagen were pH 2.6，material to liquid ratio（w/v）1∶30，30℃，200 U/g pepsin addition，extraction time 24 h，and the yield of extracted collagen reached 70.28%（12.76%when compared with the initial weight of Tilapia bone）.Then，the extracted crude collagen was further purified and its physicochemical property was determined by the methods of SDSPAGE，UV and FT-IR scanning，DSC，CD and amino acid analysis.The results indicated that the extracted Tilapia bone collagen belongs to typical collagenⅠwith two α and one β chains. Furthermore，the Tilapia bone collagen contains high percentages of Gly，Pro，Hyp，Glu and Ala and its denaturation temperature was 34.5℃.In conclusion，the extracted Tilapia bone collagen by pepsin digestion has a higher yield and purity.

TS 254.9；S 986.3

A

1673—1689（2015）03—0302—09

2014-03-08

安徽省115產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目（2012d5t146）；省部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合重點(diǎn)項(xiàng)目（2012B091000121）。

*通信作者：陸劍鋒（1976—），男，江蘇常州人，理學(xué)博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事水生動(dòng)物資源的保護(hù)和綜合利用研究。

E-mail：lujf@sibs.ac.cn