轉(zhuǎn)錄因子Stat5a對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響及其表觀遺傳學(xué)機(jī)制探討

張 潔，唐培志，黃建軍，譚敦勇△

(1.吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，湖南吉首 416000；2.湘西自治州人民醫(yī)院外科，湖南吉首 416000)

·論 著·

轉(zhuǎn)錄因子Stat5a對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響及其表觀遺傳學(xué)機(jī)制探討

張 潔1，唐培志2，黃建軍2，譚敦勇1△

(1.吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，湖南吉首 416000；2.湘西自治州人民醫(yī)院外科，湖南吉首 416000)

目的 探討轉(zhuǎn)錄因子Stat5a對人類乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)增殖的影響及表觀遺傳學(xué)機(jī)制。方法利用腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，使MCF-7大量表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Stat5a，應(yīng)用活細(xì)胞計數(shù)(MTS)法檢測細(xì)胞增殖情況，并以染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)方法，檢測p53基因啟動子區(qū)域組蛋白甲基化程度。最后以實時定量PCR進(jìn)一步確認(rèn)p53基因表達(dá)水平。結(jié)果攜帶Stat5a cDNA的腺病毒感染后，MCF-7的數(shù)量呈劑量依賴式地增加。當(dāng)病毒感染增殖活性(MOI)分別為10、20及30時，MCF-7的細(xì)胞密度較對照組細(xì)胞分別增加7.603 1%、18.123 7% 及24.898 7%。染色質(zhì)免疫共沉淀分析表明，Stat5a明顯導(dǎo)致p53基因啟動子區(qū)域組蛋白甲基化(H3K27Me3)增加，p53基因表達(dá)水平下降。結(jié)論Stat5a導(dǎo)致MCF-7抑癌基因p53啟動子組蛋白甲基化，使啟動子活性降低，導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖。

轉(zhuǎn)錄因子Stat5a；乳腺腫瘤細(xì)胞；表觀遺傳學(xué)；組蛋白甲基化；染色質(zhì)免疫共沉淀

轉(zhuǎn)錄因子Stat5(signal transducer and activator of transcription 5)是催乳素(PRL)、生長因子以及一系列細(xì)胞因子信號通路的重要環(huán)節(jié)[1-2]，在乳腺發(fā)育、分化[3]及泌乳[4]等生理活動中起著極為重要的作用[5-6]。有證據(jù)表明，Stat5的異常表達(dá)可能參與了某些生殖腫瘤尤其是乳腺癌及前列腺癌等的病理過程[7]。但有關(guān)Stat5在乳腺癌及前列腺癌形成、發(fā)展及預(yù)后中的確切作用，目前尚無定論，且有關(guān)此方面的報道，多相互矛盾[8-9]。本研究除了檢測及確認(rèn)Stat5a對培養(yǎng)狀態(tài)的人類乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的影響外，利用染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)分析法，分析高表達(dá)Stat5a后，p53基因啟動子區(qū)域表觀遺傳學(xué)修飾的改變(組蛋白甲基化)，以期闡明Stat5a與乳腺癌的病理聯(lián)系及其可能的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人類乳腺癌細(xì)胞(MCF-7，中南大學(xué)細(xì)胞庫)、 RPMI 1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司)、H3K27Me3抗體(美國Millimore公司)、p53抗體(美國Santa Cruz生物公司)、細(xì)菌蛋白G磁珠(美國Invitrogen公司)、細(xì)胞增殖分析試劑MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium]，以及蛋白印跡顯影試劑ECL(enhanced chemiluminescent substrate,美國Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 攜帶Stat5a cDNA腺病毒制作 為提高基因轉(zhuǎn)移效率，本研究采用腺病毒基因轉(zhuǎn)移法。其制作方法依據(jù)Stratagene公司建議的制作程序，基本步驟如下：(1)將Stat5a cDNA 克隆至穿梭載體(pShuttle-IRES-hrGFP-1)；(2)利用同源重組原理將穿梭載體的Stat5a cDNA上傳到腺病毒基因組(Ad5)，該病毒基因組經(jīng)人工改造去掉其與病毒復(fù)制有關(guān)的E1及E2序列；(3)確認(rèn)重組成功后，將其轉(zhuǎn)入經(jīng)特殊處理的細(xì)菌株(XL10-Gold?)大量擴(kuò)增(重組體在該細(xì)菌內(nèi)只能擴(kuò)增但不能再發(fā)生新的重組以保證重組的準(zhǔn)確及穩(wěn)定)；(4)提取重組體，以限制性內(nèi)切酶PacⅠ進(jìn)行酶切處理以暴露其末端反向重復(fù)序列(invert terminal repeat,ITR)，然后將其轉(zhuǎn)入AD-293細(xì)胞，使其包裝成有活性的病毒；(5)病毒活性(滴度)以病毒感染AD-293細(xì)胞后形成病毒斑塊的能力(plaque forming unit,PFU)表示，而PFU總數(shù)與待感染的細(xì)胞總數(shù)之比值即為病毒感染增殖活性(multiplicity of infection,MOI)。

表1 引物序列

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移及活細(xì)胞計數(shù)(MTS)法 MCF-7用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10.0%胎牛血清)在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞的貼壁密度或貼壁面積為70%時，棄去培養(yǎng)液，用含0.5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h(細(xì)胞處于饑餓狀態(tài))以使所有細(xì)胞均處于G0期后，換為正常培養(yǎng)液，恢復(fù)3 h后，細(xì)胞分為5組：2個對照組及3個實驗組。2個對照組的培養(yǎng)液中加入不攜帶Stat5a cDNA的腺病毒，3個實驗組加入攜帶Stat5a cDNA的腺病毒。3個實驗組及對照組中的一個均同時加入PRL(50 ng/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入MTS試劑并測定其波長為492 nm的吸光度值，得到相對活細(xì)胞計數(shù)。

1.2.3 ChIP分析 MCF-7經(jīng)病毒感染處理后，吸棄培養(yǎng)液，并以冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，然后：(1)以新鮮配制的1%甲醛固定，10 min后，以甘氨酸終止甲醛活性；(2)吸棄甲醛固定液，以細(xì)胞收集液(100 mmol/L Tris-Cl,pH 9.4,10 mmol/L DTT)收集細(xì)胞，冰冷PBS洗細(xì)胞3次，加入細(xì)胞裂解液(1% SDS，10 mmol/L EDTA,pH 8.0,50 mmol/L Tris-Cl,pH8.1,1×蛋白酶抑制劑)，并以超聲粉碎儀(Bioruptor)破碎基因組DNA至500 bp左右片段；(3)以ChIP稀釋液[1% Triton X-100,2 mmol/L EDTA,150 mmol/L NaCl,20 mmol/L Tris-Cl,pH 8.1,1 (蛋白酶抑制劑)]1∶10稀釋；(4)加入H3K27Me3抗體，4 ℃輕搖過夜(與此同時，另設(shè)一平行管，加入IgG以得到非特異性結(jié)合的數(shù)據(jù))；(5)以含細(xì)菌蛋白G的磁珠沉淀；(6)以洗脫液(1% SDS，TE緩沖液配制)將DNA H3K27Me3抗體復(fù)合物自磁珠上洗脫；(7)65 ℃過夜以解除固定，繼之用蛋白酶H消化蛋白(抗體)；(8)純化DNA；(9)實時定量PCR(qRT-PCR)檢測、確認(rèn)被抗H3K27Me3抗體沉淀的DNA中p53基因啟動子區(qū)域DNA序列的含量。

1.2.4 qRT-PCR檢測 (1)引物設(shè)計：用于本研究的PCR引物包括用于檢測ChIP后DNA的引物(對應(yīng)于p53基因啟動子序列進(jìn)行設(shè)計)及用于檢測p53 mRNA的引物(表1)；(2)底物：SYNR Green；(3)PCR 參數(shù)：變性95 ℃ 1 min，退火55 ℃，30 s，延伸72 ℃,30 s，收集40個循環(huán)的熒光強(qiáng)度，并得到相應(yīng)的Ct值；(4) ChIP：DNA的相對量以總DNA量(Input)為參照，計算其被沉淀的p53 啟動子序列DNA占總DNA量的百分?jǐn)?shù)，p53 mRNA的相對量則以管家基因18S rRNA為對照計算。

1.2.5 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測 MCF-7經(jīng)攜帶Stat5a cDNA的腺病毒感染后，吸棄培養(yǎng)液，并經(jīng)冰冷PBS洗3次，收集細(xì)胞并加入細(xì)胞裂解液(RIPA)，12 000 r/min離心，收集上清液，測定蛋白濃度，然后進(jìn)行下述步驟。(1)電泳分離：樣本加入上樣液并經(jīng)煮沸5 min變性，每孔上樣20 μg,100 V電泳90 min；(2)轉(zhuǎn)膜：應(yīng)用半干轉(zhuǎn)膜裝置(Bio-Rad)7 V轉(zhuǎn)膜45 min；(3)抗原抗體反應(yīng)：上述經(jīng)蛋白轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜，經(jīng)磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗3次(每次10 min)并經(jīng)非特異位點封閉后，加入p53抗體，4 ℃過夜，第2天進(jìn)行二抗反應(yīng)；(4)顯影：運(yùn)用ECL試劑并經(jīng)X線片記錄發(fā)光強(qiáng)度及位置。

2 結(jié) 果

2.1 Stat5a對人類乳腺癌細(xì)胞增殖的影響 2組對照細(xì)胞，分別給予或不給予PRL處理后，二者之間的活細(xì)胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。3組實驗組細(xì)胞，則由于感染攜帶Stat5a cDNA的腺病毒，在加入PRL的情況下，其活細(xì)胞計數(shù)均明顯增加，且與腺病毒的劑量(MOI)呈劑量依賴關(guān)系。當(dāng)MOI分別為10、20及30時，MCF-7的活細(xì)胞相對計數(shù)分別為1.283 2±0.025 9，1.408 6±0.019 2及1.489 4±0.017 6，較對照組2(Con 2)細(xì)胞分別增加7.603 1%、 18.123 7% 及24.898 7%，見圖1。

Con:對照組；NS:差異非顯著；*：P<0.05,**：P<0.01，與對照組比較。

圖1 過表達(dá)Stat5a基因?qū)θ祟惾橄侔┘?xì)胞增殖的影響

2.2 Stat5a對MCF-7 p53基因啟動子組蛋白甲基化的影響 過表達(dá)Stat5a的細(xì)胞，其染色質(zhì)沉淀中含有大量被抗H3K27Me3沉淀的DNA片段。對照組與實驗組，其沉淀DNA比例分別為(0.007 8±0.000 4)%及(0.094 0±0.011 2)%(圖2)。為了消除非特異性結(jié)合的影響，本研究還使用了非特異性IgG抗體進(jìn)行沉淀，結(jié)果表明所有組別的DNA沉淀比例均低于0.009 0%。此外，為消除引物對基因組DNA的非特異性結(jié)合的影響，本研究設(shè)計了平行實驗，運(yùn)用無關(guān)引物進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，無關(guān)引物并沒有探測到明顯DNA片段，見圖2。

Con:對照組;**：P<0.01，與對照組比較。

圖2 過表達(dá)Stat5a對乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)p53基因啟動子組蛋白甲基化的影響

2.3 Stat5a過表達(dá)對p53基因表達(dá)的影響 細(xì)胞在轉(zhuǎn)入含有Stat5a cDNA的腺病毒后，p53 mRNA及蛋白水平下降非常明顯，與對照細(xì)胞相比，細(xì)胞在分別轉(zhuǎn)入腺病毒10、20、 30 MOI后，對照組及3個實驗組的p53 mRNA相對量分別為0.620 0±0.040 6，0.519 4±0.073 5，0.471 9±0.015 7及0.078 9±0.004 9，分別下降16.225 8%、23.897 1%及87.267 1%。p53蛋白則分別下降24.650 3%、 27.825 1%及 69.784 1%，見圖3。

A：p53 mRNA表達(dá)水平(qRT-PCR);B:p53蛋白表達(dá)水平。Con:對照組;NS:差異非顯著；*:P<0.05,**:P<0.01，與對照組比較。

圖3 Stat5a過表達(dá)對p53基因表達(dá)的影響

3 討 論

Stat5a作為轉(zhuǎn)錄因子，主要介導(dǎo)PRL等的生物學(xué)作用，而PRL及其受體的過表達(dá)已經(jīng)被證實是促進(jìn)人類生殖系統(tǒng)癌癥如乳腺癌及前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一[1-4]。因而，有人推測Stat5a與乳腺癌等的形成和發(fā)展之間存在一定的病理聯(lián)系[8]。然而，有關(guān)Stat5a在乳腺癌的形成、發(fā)展及預(yù)后方面的具體作用，目前尚無定論。盡管已經(jīng)有不少報道，將Stat5a的表達(dá)與腫瘤聯(lián)系起來，但從報道的結(jié)果看，往往相互矛盾[8-9]。為確認(rèn)Stat5a對MCF-7細(xì)胞增殖的影響，本研究采用腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法使MCF-7細(xì)胞得以過表達(dá)Stat5a。根據(jù)筆者以往經(jīng)驗，在基因轉(zhuǎn)染過程中，若采用化學(xué)轉(zhuǎn)移法人類乳腺癌細(xì)胞系如T47D及MCF-7的轉(zhuǎn)移效率較低(約50%)，因而影響實驗結(jié)果。本研究采用腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法，理論上轉(zhuǎn)移效率可以達(dá)到90%以上。結(jié)果表明，MCF-7的細(xì)胞密度，過量表達(dá)Stat5a之后，顯著上升，且呈劑量依賴關(guān)系。此外，由于PRL是Stat5a的有效激活劑，筆者設(shè)置了兩組對照，兩組對照均以不攜帶Stat5a cDNA的腺病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其中一組細(xì)胞不加入PRL，而另一組對照則加入PRL以激活Stat5a。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入PRL的對照組，雖然沒有過量表達(dá)外源Stat5a，但細(xì)胞密度亦有少量增加，應(yīng)為PRL激活內(nèi)源性Stat5a所致。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，至少在細(xì)胞增殖方面，Stat5a所起作用為病理性的。

p53是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵因子之一，其表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有一定關(guān)系[10-11]。為闡明Stat5a的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用是否與p53有關(guān)，本研究運(yùn)用ChIP，對過表達(dá)Stat5a后的乳腺癌細(xì)胞p53 基因啟動子區(qū)域的表觀遺傳學(xué)修飾進(jìn)行了檢測。在攜帶Stat5a cDNA的腺病毒轉(zhuǎn)染，并經(jīng)1%甲醛固定后，MCF-7 染色質(zhì)DNA經(jīng)超聲粉碎至500 bp左右片段，以抗H3K27Me3抗體對DNA片段進(jìn)行沉淀。結(jié)果表明，p53基因啟動子區(qū)域DNA被大量沉淀，說明過表達(dá)Stat5a能夠促進(jìn)p53基因啟動子區(qū)域組蛋白3第27位賴氨酸的甲基化(H3K27Me3)修飾。H3K27Me3對基因組DNA與組蛋白的相互作用具有非常直接的影響，大量研究表明，這一修飾能夠嚴(yán)重干擾與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的蛋白質(zhì)因子進(jìn)入基因啟動子區(qū)域，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[12]。為確認(rèn)H3K27Me3對p53基因表達(dá)的影響，本研究應(yīng)用qRT-PCR對p53 mRNA進(jìn)行檢測，結(jié)果正如預(yù)期，p53 mRNA水平隨著病毒量的增加而降低，應(yīng)為p53基因啟動子因甲基化而被抑制的結(jié)果。蛋白印記進(jìn)一步顯示，蛋白水平亦下降明顯。

綜上所述，Stat5a有促進(jìn)MCF-7增殖的作用，其分子機(jī)理之一是通過改變p53啟動子區(qū)域的組蛋白表觀遺傳學(xué)修飾，促進(jìn)H3K27Me3甲基化，從而抑制p53基因的表達(dá)。

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Influence of transcription factor Stat5a on proliferation of human breast cancer cells and its epigenetic mechanisms*

ZhangJie1,TangPeizhi2,HuangJianjun2,TanDunyong1△

(1.DepartmentofBiochemistry,MedicalCollegeofJishouUniversity,Jishou,Hunan416000,China;2.DepartmentofSurgery,HunanWestAutonomousRegionPeople′sHospital,Jishou,Hunan416000,China)

Objective To investigate and clarify the effect of Stat5a on proliferation of human breast cancer cells (MCF-7) and to detect the changes of epigenetic signature on the promoter region of p53 gene.Methods Stat5a was over expressed in human breast cancer cells (MCF-7) by using adenovirus mediated gene transfer technology.The cell proliferation was examined by MTS assay.ChIP assay was used to check the trimethylation of lysine 27 on histone 3 (H3K27Me3) of p53 gene promoter region.Furthermore,qRT-PCR and western blot were also applied to confirm the expression of p53 gene.Results The number of MCF 7 increased in a dose dependent manner.Compared with that of control group,the cell density of MCF-7 increased 7.603 1%,18.123 7% and 24.898 7% when the MOI were 10,20 and 30.Chromatin Immunoprecipitation showed that Stat5a significantly increased H3K27Me3 and down regulated the expression level of p53 gene.Conclusion Stat5a promotes proliferation of breast cancer cells through trimethylation of H3K27 and inhibition of p53 gene expression.

Stat5a transcription factor;breast cancer cells;epigenetics;histone methylation;chromatin immunoprecipitation

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.19.002

國家自然科學(xué)基金資助項目(81172497,81260396)；吉首大學(xué)研究生科研創(chuàng)新資助項目(JGY201317)。

張潔(1988-)，碩士，主要從事腫瘤的表觀遺傳學(xué)研究。

△通訊作者,Tel：15174302136；E-mail：naturet2010@163.com。

R737.9，Q786

A

1671-8348(2015)19-2596-04

2014-11-18

2015-02-20)