阿托伐他汀抵抗吸煙相關(guān)性血管內(nèi)皮損傷的實(shí)驗(yàn)研究

郭 軼，盧小剛△，代遠(yuǎn)斌

(1.重慶市中醫(yī)院普外科 400021；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科 400016)

論著·基礎(chǔ)研究

阿托伐他汀抵抗吸煙相關(guān)性血管內(nèi)皮損傷的實(shí)驗(yàn)研究

郭 軼1，盧小剛1△，代遠(yuǎn)斌2

(1.重慶市中醫(yī)院普外科 400021；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科 400016)

目的 探討阿托伐他汀對吸煙相關(guān)性血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用。方法將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)分為對照組、香煙提取物處理組和阿托伐他汀聯(lián)合香煙提取物處理組。觀察不同組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，并檢測不同組細(xì)胞中血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)和E-選擇素(E-selectin)的蛋白表達(dá)。結(jié)果香煙提取物處理組HUVECs的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了劇烈的變化，失去了基本形態(tài)；而阿托伐他汀聯(lián)合香煙提取物處理組HUVECs的細(xì)胞形態(tài)僅發(fā)生了輕微的改變，保留了基本形態(tài)。同時(shí)VCAM-1和E-selectin蛋白在香煙提取物處理組細(xì)胞中表達(dá)明顯高于對照組和阿托伐他汀聯(lián)合香煙提取物處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；VCAM-1和E-selectin蛋白在阿托伐他汀聯(lián)合香煙提取物處理組細(xì)胞中的表達(dá)稍高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論阿托伐他汀可以抵抗吸煙導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷，具有血管內(nèi)皮保護(hù)作用，可用于治療吸煙相關(guān)性血管疾病。

血管細(xì)胞黏附分子-1；E-選擇素；吸煙；阿托伐他??；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

許多研究指出吸煙與多種血管疾病密切相關(guān)[1-2]，并且吸煙相關(guān)性血管內(nèi)皮炎癥在血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起非常重要的作用[3-4]。因此，減少血管內(nèi)皮炎癥的藥物可能在治療吸煙導(dǎo)致的血管疾病中起重要作用。阿托伐他汀是一種廣泛運(yùn)用的降脂藥物，有實(shí)驗(yàn)指出其有降低炎性反應(yīng)的作用[5]。本實(shí)驗(yàn)中，筆者檢測重要的血管炎癥因子在不同實(shí)驗(yàn)組中的蛋白表達(dá)，擬探討阿托伐他汀對吸煙相關(guān)性血管內(nèi)皮損傷的抵抗作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。阿托伐他汀由美國輝瑞制藥公司提供。血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和E-選擇素(E-selectin)抗體(Santa Cruz)，GAPDH(Gen Script公司)。

1.2 方法

1.2. 1香煙提取物的制備 宏聲牌香煙(重慶煙草工業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn))參照美國聯(lián)邦委員會[6]推薦的香煙煙霧標(biāo)準(zhǔn)采氣速率，每2秒抽氣35 mL，間隔58 s抽氣1次，直至靠近煙蒂2.0～3.0 mm處。連續(xù)抽取5支香煙，使香煙煙霧提取物的濃度為1支/mL。以5 mL DMEM為吸收液，用50 mL注射器抽吸。最后用0.22 μL孔徑的濾膜過濾待用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 實(shí)驗(yàn)分為3組：對照組(NC組)、香煙提取物處理(cigarette smoking extract,CES)組和阿托伐他汀聯(lián)合香煙提取物處理(atorvastatin and cigarette smoking extract,AS+CES)組。NC組為常規(guī)HUVECs，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，不接受任何處理；CES組為常規(guī)HUVECs，用10%的香煙提取物的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；AS+CES組為常規(guī)HUVECs，先用10 μmol/L的阿托伐他汀的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)4 h，再更換含10%的香煙提取物的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。所有細(xì)胞處理后培養(yǎng)12 h，再用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察并收集細(xì)胞提取總蛋白進(jìn)行蛋白檢測。

1.2.3 Western blot檢測 收集轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞，提取總蛋白。50 μg蛋白裂解液經(jīng)12%丙烯酰胺凝膠電泳后，行PVDF轉(zhuǎn)膜，并用5% BSA封閉1 h。封閉后的膜加PDGF-B一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，次日用HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h，ECL顯色曝光。GAPDH作為內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1 不同組HUVECs的形態(tài)觀察 NC組為正常的HUVECs，為長梭形，核漿比正常。在CES組中，HUVECs的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了劇烈的變化，由長梭形變?yōu)榱饲蛐危⒂性S多空泡形成；而且可見許多壞死細(xì)胞。在AS+CES組中，HUVECs的細(xì)胞形態(tài)僅發(fā)生了少許的變化，部分細(xì)胞形態(tài)由長梭形變?yōu)榱饲蛐?，但沒有空泡形成，也沒有出現(xiàn)細(xì)胞壞死。見圖1。

A：NC組，B：CES組，C：AS+CES組。

圖1 顯微鏡觀察不同組中HUVECs的細(xì)胞形態(tài) (×200)

2.1 不同組HUVECs的VCAM-1和E-selectin蛋白表達(dá) VCAM-1和E-selectin蛋白在CES組HUVECs中的表達(dá)(0.901±0.036,0.833±0.031)明顯高于NC組(0.008±0.002,0.189±0.002)和AS+CES組(0.176±0.005,0.422±0.017)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)VCAM-1和E-selectin蛋白在AS+CES組HUVECs中的表達(dá)雖稍高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但VCAM-1和E-selectin蛋白在AS+CES組HUVECs中的表達(dá)卻明顯低于CES組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

A:NC組；B:CSE組；C:AS+CSE組。#：P<0.05，與 NC組比較；※：P<0.05，與CES組比較。

圖2 VCAM-1和E-selectin蛋白在不同組HUVECs中的表達(dá)

3 討 論

全球范圍內(nèi)，吸煙導(dǎo)致的血管疾病的發(fā)病率及死亡率均呈現(xiàn)逐年增高的趨勢[7]。血管舒縮功能障礙、凝血及纖溶系統(tǒng)異常、脂質(zhì)代謝異常、血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥、氧化應(yīng)激等多種因素均參與了吸煙相關(guān)性血管疾病的發(fā)病；其中血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激的作用尤為突出[8]。雖然吸煙相關(guān)性血管疾病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥已被廣泛證實(shí)為導(dǎo)致吸煙相關(guān)性血管疾病發(fā)病的主要因素[2]。阿托伐他汀是一種運(yùn)用廣泛的降血脂藥物，并且其被證實(shí)有明確的抗炎癥作用[5,9]。因此，筆者推斷阿托伐他汀可以通過抑制血管內(nèi)皮炎癥進(jìn)而抵抗吸煙相關(guān)性血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)采用阿托伐他汀作為血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)劑，對比使用阿托伐他汀組與常規(guī)組HUVECs的抗香煙提取物損傷能力，進(jìn)而探討阿托伐他汀作為抵抗吸煙相關(guān)性血管疾病的應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CSE組中HUVECs的形態(tài)發(fā)生了劇烈的變化，出現(xiàn)了大量的細(xì)胞壞死。而AS+CSE組中HUVECs的形態(tài)僅發(fā)生了輕微的變化，并且沒有出現(xiàn)細(xì)胞壞死。證實(shí)阿托伐他汀可以明顯抵抗香煙誘發(fā)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，保護(hù)血管內(nèi)皮功能。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步檢測了兩種血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子VCAM-1和E-selectin的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CSE組HUVECs中的VCAM-1和E-selectin蛋白的表達(dá)明顯高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)AS+CSE組HUVECs中的VCAM-1和E-selectin蛋白的表達(dá)雖稍高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，但卻明顯低于CSE組。VCAM-1是重要的免疫球蛋白超家族成員之一，是一種重要的細(xì)胞黏附分子，廣泛表達(dá)在活化內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等表面，其生物學(xué)作用十分廣泛。其最主要的作用為誘導(dǎo)細(xì)胞黏附，血管內(nèi)皮細(xì)胞中VCAM-1的高表達(dá)可誘導(dǎo)白細(xì)胞和炎癥因子的黏附進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮炎癥[10-11]。E-selectin是選擇素家族中的主要成員之一，其主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞活化后可合成E-selectin并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面，誘導(dǎo)白細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮炎癥[12]。結(jié)果證實(shí)阿托伐他汀可以降低吸煙導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)炎癥黏附分子的表達(dá)，進(jìn)而抵抗吸煙相關(guān)性血管炎的發(fā)生。

綜上所述，吸煙是誘發(fā)血管疾病的重要病因，其不僅可以直接誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，還可以介導(dǎo)多種細(xì)胞黏附分子的高表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)血管炎癥。阿托伐他汀是常用的降脂藥物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示阿托伐他汀可以保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞抵抗吸煙相關(guān)性損傷，并降低血管內(nèi)皮細(xì)胞中相關(guān)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，減少血管炎癥，值得臨床推廣。但阿托伐他汀抵抗吸煙相關(guān)性血管疾病的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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Investigation about atorvastatin resist to tobacco smoking inducing endothelial inflammation

GuoYi1,LuXiaogang1△，DaiYuanbin2

(1.DepartmentofGeneralSurgery,ChongqingTraditionalChineseMedicineHospital,Chongqing400021,China;2.DepartmentofVascularSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To explore the role of atorvastatin resist to tobacco smoking inducing endothelial inflammation.Methods HUVECs were divided into normal control group,cigarette smoking extract(CSE) group and atorvastatin(AS)+CSE group.The cellular morphology of HUVECs in three group were observed,then the expressions of VCAM-1 and E selectin in HUVECs in three group were detected by western blot assay.Results In CES group,drastic morphological change of HUVECs were observed.In AS+CSE group,minor morphological change of HUVECs were observed.Also,the protein levels of VCAM-1 and E selectin were much higher in CSE group than that of in other two groups(P<0.05),and the protein levels of VCAM-1 and E-selectin in AS+CSE group were a little higher than that of in control group,but much lower than that of in CSE group(P<0.05).Conclusion Our results showed that atorvastatin might partly resist to tobacco smoking inducing endothelial inflammation.

vascular cell adhesion molecule-1;E-selectin;smoking;atorvastatin;human umbilical vein endothelial cells

郭軼(1982-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事胃腸及血管外科疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。

△通訊作者，Tel:(023)67983557；E-mail:412600792@qq.com。

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.19.008

R329.2+8

A

1671-8348(2015)19-2616-02

2014-11-18

2015-02-26)