大鼠尾椎椎間盤退變模型的建立及磁共振檢查

孫春光 周其佳 孫月柏 董啟榕

1.江蘇省阜寧縣人民醫(yī)院骨科，江蘇阜寧224400;2.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，江蘇蘇州215004

大鼠尾椎椎間盤退變模型的建立及磁共振檢查

孫春光1周其佳1孫月柏1董啟榕2▲

1.江蘇省阜寧縣人民醫(yī)院骨科，江蘇阜寧224400;2.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，江蘇蘇州215004

目的通過建立一種新的大鼠尾椎椎間盤退變模型并在磁共振成像(MRI)下進行觀察。方法隨機抽取20只SD大鼠，分為實驗組和對照組，每組各10只。手術(shù)方法以尾椎C5和C6椎體為中心，分別鉆入兩枚交叉克氏針，以定制碳纖維環(huán)固定于交叉克氏針上，通過碳纖維棒的彈簧加壓。對照組手術(shù)方法同前，區(qū)別在于通過碳纖維棒的彈簧不加壓。于術(shù)后2個月行MRI檢查。結(jié)果實驗組加壓椎體間椎間盤變小，椎體彎曲。對照組T2信號值僅輕度改變，而實驗組T2信號值明顯降低［(502.89±12.93)比(334.57±27.09)，t=9.712，P＜0.05］。結(jié)論椎體加壓模型可成功復(fù)制靜態(tài)壓力所致椎間盤退變，為深入研究椎間盤退變分子機制及力學(xué)信號傳導(dǎo)提供基礎(chǔ)。

動物模型;大鼠;椎間盤退變;磁共振成像

椎間盤退變所致腰腿痛是嚴(yán)重影響人們健康生活的常見病與多發(fā)?。?］。到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)能夠針對發(fā)病原因的治療，臨床上主要以緩解癥狀為主。所以成功復(fù)制一種能夠高度模仿持續(xù)緩慢積累性椎間盤退變的模型并深入研究該病發(fā)病分子機制及力學(xué)信號傳導(dǎo)很有必要。本實驗建立通過外部裝置持續(xù)靜態(tài)壓力致椎間盤退變的模型，該模型能夠模仿人長期彎腰緩慢積累所致椎間盤退變，并定期在核磁共振檢查下驗證椎間盤信號的改變?，F(xiàn)報道如下:

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組

SD大鼠20只，由蘇州大學(xué)實驗動物中心提供，雌性，體重(300±50)g，平均3月齡(骨性成熟)。篩選標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)影像學(xué)(DR、MRI)檢查無尾椎椎間盤病變的健康鼠。隨機分為實驗組和對照組，每組各10只。按標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下單籠飼養(yǎng)［蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院實驗動物中心(以下簡稱“我中心”)SD大鼠飼養(yǎng)室，標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)，室溫25℃］。

1.2 主要實驗設(shè)備及儀器

動物解剖器械，骨科手術(shù)電鉆，0.8 mm無菌克氏針(康輝公司)，定制纖維環(huán)、棒和螺帽，定制彈簧，游標(biāo)卡尺，1.5T超導(dǎo)型磁共振掃描儀(飛利浦公司)。

1.3 模型的建立

術(shù)前實驗動物標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)1個月。采用3.6%水合氯醛(我中心提供)，10mL/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后，將SD大鼠仰臥位置于操作臺上，固定四肢，尾部消毒鋪巾。術(shù)者根據(jù)大鼠尾部體表標(biāo)記確定C5、C6，分別于椎體中間部位左右傾斜45°交叉鉆入直徑0.8mm克氏針兩枚，注意避開尾動靜脈血管。相繼固定碳纖維環(huán)于交叉克氏針上，套入碳纖維棒及彈簧。實驗組給予彈簧螺帽固定加壓，壓縮4枚彈簧均為10 mm/kg體重(模擬大鼠直立行走時腰椎所承受的自身體重)，彈簧壓縮長度由游標(biāo)卡尺控制;對照組對彈簧不加壓。見圖1。術(shù)后兩組動物單籠飼養(yǎng)，青霉素20萬U肌注3 d，并予75%酒精針孔滴注，預(yù)防感染。如有感染者剔除。

圖1 SD大鼠尾椎加壓模型照片

1.4 核磁共振檢查

兩組動物術(shù)后2個月，隨機抽取3只采用飛利浦公司1.5T超導(dǎo)型核磁共振掃描檢查。了解脊柱尾椎組織形態(tài)變化及磁共振反映椎間盤的信號變化。術(shù)后2個月時檢查結(jié)果由不同影像科醫(yī)師隨機單盲閱讀并提出，運用計算機影像閱讀分析系統(tǒng)分析成像結(jié)果，提取C5～C6整個椎間盤和其內(nèi)呈高信號區(qū)域信號值。圖像隨機選擇，選中的每幅圖像均執(zhí)行3次反復(fù)測量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

所有大鼠術(shù)后均成活，未發(fā)生明顯感染。對照組尾椎椎體排列有序，輕微前凸，未出現(xiàn)椎體側(cè)彎及后突畸形，椎間盤高度未見明顯降低;T2信號椎間盤呈高信號，椎體周圍韌帶清晰，在椎間盤部位未出現(xiàn)壓跡(圖2a)。實驗組在術(shù)后2個月時，C5～C6椎間盤T2信號呈低強度改變，與對照組比較明顯降低。椎體周圍纖維環(huán)彎曲變形，椎間盤部位出現(xiàn)壓跡(圖2b)。實驗組與對照組均于術(shù)后2個月進行手術(shù)節(jié)段(C5～C6)椎間盤T2信號值的比較，由資深放射科醫(yī)生指導(dǎo)測量感興趣的區(qū)域(region of interest，ROI)(圖3)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，表1)。同時對實驗組和對照組上節(jié)段(C4～C5)椎間盤和下節(jié)段(C6～C7)椎間盤T2信號值進行相應(yīng)比較，實驗組和對照組上、下相鄰節(jié)段之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，表1)。

圖2 對照組與實驗組矢狀位MRI的T2像

圖3 計算機銀屏俘獲圖

表1 實驗組與對照組各節(jié)段椎間盤髓核矢狀MRI的T2加權(quán)像信號值比較()

表1 實驗組與對照組各節(jié)段椎間盤髓核矢狀MRI的T2加權(quán)像信號值比較()

組別上節(jié)段( C4～C5)手術(shù)節(jié)段( C5～C6)下節(jié)段( C6～C7)實驗組對照組t值P值5 1 4 . 1 2 ± 8 . 9 7 5 4 0 . 1 0 ± 1 4 . 4 2 2 . 6 5 0＞0 . 0 5 3 3 4 . 5 7 ± 2 7 . 0 9 5 0 2 . 8 9 ± 1 2 . 9 3 9 . 7 1 2＜0 . 0 5 6 6 8 . 5 8 ± 8 . 9 0 6 8 2 . 6 0 ± 1 2 . 4 6 1 . 5 8 6＞0 . 0 5

3 討論

椎間盤退變是人類機體老化過程中不可避免的退行性改變，不恰當(dāng)?shù)纳罟ぷ髁?xí)慣常常導(dǎo)致椎間盤突出，出現(xiàn)腰腿痛等一系列臨床癥狀。椎間盤退變病因復(fù)雜，可能與遺傳、超重負(fù)荷、營養(yǎng)狀況、激素水平等都有密切關(guān)系［2-5］。長期過度的機械負(fù)荷直接誘發(fā)組織結(jié)構(gòu)重塑，從而損害組織基質(zhì)中蛋白質(zhì)和酶在合成過程中機械力學(xué)發(fā)生的改變［6］。椎間盤退變往往以髓核、纖維環(huán)及軟骨終板的組成成分變化為基礎(chǔ)，諸如髓核組織含水量下降和黏彈性降低、纖維環(huán)膠原變性、細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡等［7］，使椎體間發(fā)生異常性生物力學(xué)改變，導(dǎo)致椎體間力學(xué)性能退化，從而造成椎間盤組織可復(fù)性下降，椎間盤傳遞應(yīng)力集中，軟骨終板及纖維環(huán)出現(xiàn)裂隙甚至破裂。當(dāng)椎間盤的壓力驟然增加及纖維環(huán)進一步損壞時，椎間盤組織突出引起臨床癥狀。

本實驗通過給予大鼠尾椎椎間盤施加持續(xù)靜態(tài)應(yīng)力，改變椎體間生物力學(xué)，間接造成椎間盤慢性損傷性退變［8］，從而建立外部裝置產(chǎn)生動力軸向靜態(tài)加壓模型。椎間盤退變實驗研究需尋找合適動物，建立模型為實驗提供基礎(chǔ)平臺，這樣可以最大程度節(jié)省人力、物力，并提高實驗可重復(fù)性［9］。大鼠椎間盤解剖結(jié)構(gòu)及生化組成與人類十分相似，并且與大型動物(牛、羊、豬等)相比，具有廉價、易飼養(yǎng)、適合重復(fù)實驗等優(yōu)點［10］。故本實驗選擇大鼠作為實驗動物。目前建立椎間盤退變動物模型的方法很多，如用纖細(xì)針頭穿刺破壞椎間盤周圍纖維環(huán);經(jīng)過椎體損傷椎間盤的軟骨終板;向髓核內(nèi)注射降解酶(透明質(zhì)酸酶、木瓜凝乳酶等)消融髓核;通過改變脊柱生物力線，間接地造成椎間盤損傷等［11-14］，但都存在各種各樣的不足和缺陷［15］。異常的生物力學(xué)因素特別是持續(xù)反復(fù)的應(yīng)力集中在椎間盤退變過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。人體直立行走或彎腰姿勢，脊柱特別是下腰椎承受巨大應(yīng)力。長期過量負(fù)荷、慢性勞損會導(dǎo)致椎間盤脫水、變性，從而發(fā)生退變甚至突出。熊蠡茗等［16］通過建立可控軸向壓力誘發(fā)的兔椎間盤退變模型可以高效誘發(fā)椎間盤退變，尤其在輕、中度椎間盤退變方面具有優(yōu)勢。本實驗中大鼠尾椎通過彈簧施加大鼠自身一倍體重的壓力，高度模仿人椎間盤長期緩慢累積性損傷，其椎間盤組織的應(yīng)力水平上升，就可導(dǎo)致或加速椎間盤的退變進程。因此，作為直立動物的人與爬行動物的大鼠的椎體受到生物力學(xué)的異常改變后，均可直接或間接作用于椎間盤而發(fā)生退變。

本實驗應(yīng)用核磁共振成像技術(shù)檢測椎間盤退變情況。MRI對診斷椎間盤退變具有高度的特異性和敏感性，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床工作中。MRI成像具有多參數(shù)、多方位、多序列以及軟組織分辨力高的特點，常常用于對椎間盤退行性疾病的評估，被認(rèn)為是評價髓核、纖維環(huán)生化狀態(tài)的好方法［17-20］。磁共振檢查有定性和定量兩種方法，目前MRI定量技術(shù)主要是測量椎間盤ROI的各種磁共振成像參數(shù)(如T2弛豫時間、Tlrho、MTR以及表觀彌散系數(shù)值等)或信號強度值，提供并反映ROI的組織代謝和生物化學(xué)特性［21-25］。該檢測方法能夠在椎間盤發(fā)生形態(tài)改變之前反映組織學(xué)改變，是量化分析椎間盤退變程度的新方法。有研究表明以表觀彌散系數(shù)=1.05×10-3mm2/s作為評價椎間盤狀態(tài)定量指標(biāo)，其靈敏度為73.48%，特異度為75.30%［26］。T2值能夠準(zhǔn)確反映組織的固有特性，是一種定量的客觀指標(biāo)。增加組織水分或蛋白聚糖的濃度可使T2值升高，而增加膠原蛋白含量或破壞椎間盤結(jié)構(gòu)完整性可使T2值降低。另外，日?；顒右部梢詫ψ甸g盤T2值造成影響。髓核組織的T2值決定其信號強度，水分含量高的組織T2值強，MRI表現(xiàn)為高信號。Chatanl等［27］對羊離體椎間盤組織T2值與其含水量的相關(guān)分析中顯示，信號強度在組織含水量＞75%時隨含水量變化而變化，兩者正相關(guān)。Watanabe等［28］發(fā)現(xiàn)T2信號值降低與退變椎間盤髓核內(nèi)水含量減少有關(guān)，能夠在椎間盤退變前較早發(fā)現(xiàn)椎間盤變性。Marinelli等［29］測量14頭小牛和5具尸體椎間盤組織的T2弛豫時間、水和蛋白聚糖含量，發(fā)現(xiàn)髓核和纖維環(huán)的水含量與T2弛豫時間密切相關(guān)，而蛋白聚糖的含量與其無明顯相關(guān)性。牛剛等［30］認(rèn)為椎間盤纖維環(huán)T2值不易評價早期椎間盤退變，髓核T2值能更好反映椎間盤退變各分級間的差異，且有很好的相關(guān)性。故本實驗MRI檢查采用髓核為考察對象，發(fā)現(xiàn)正常未退變髓核信號均勻，與纖維環(huán)分界清楚，在T2像上表現(xiàn)為高信號，表明水分含量高。實驗組在加壓2個月出現(xiàn)T2像的信號減低，而T2像低信號的意義主要在于反映椎間盤水分丟失＞75%。信號降低變化比形態(tài)結(jié)構(gòu)異常出現(xiàn)提早，對臨床上早期發(fā)現(xiàn)椎間盤退變具有重要指導(dǎo)意義。MRI觀察加壓后的實驗組發(fā)現(xiàn)，髓核T2像信號普遍降低，椎間盤髓核緊縮變小甚至消失，出現(xiàn)真空狀態(tài)。與此同時，椎間盤周圍纖維環(huán)彎曲、椎間盤壓跡明顯、外移及椎間隙變得狹窄，這些現(xiàn)象表明椎間盤纖維環(huán)機械強度下降、髓核退變外突，繼而椎間盤高度下降，椎間盤退變的病理生理改變逐步發(fā)生、發(fā)展。由本實驗可見，磁共振在椎間盤退變的初始階段就能發(fā)現(xiàn)異常變化，并且能夠精準(zhǔn)反映退變椎間盤的形態(tài)變化，是診斷早期椎間盤退變的可靠方法。該實驗所采用的大鼠尾椎間盤退變模型能夠較早地反映椎間盤退變，并為后續(xù)開展可付諸實施的實驗研究［31］提供一個基礎(chǔ)平臺。

然而這種方法仍有不足之處:①分析信號強度的基礎(chǔ)只是從某一平面上，而不是整個椎間盤的立體三維結(jié)構(gòu);②是一種無信號量化的不連續(xù)分級模式;③使用相鄰組織的非標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)部控制，或使用不明成分阻止信號校準(zhǔn)以補償系統(tǒng)的變化。

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Rat model establish and magnetic resonance imaging findings of experimental tail intervertebral disc degenerative

SUN Chunguang1ZHOUQijia1SUN Yuebai1DONG Qirong2▲

1.Department of Orthopaedics,the People＇s Hospital of Funing County,Jiangsu Province,Funing 224400,China;2.Department of Orthopaedics,the Second Hospital Affiliated to Soochow University,Jiangsu Province,Suzhou 215004, China

ObjectiveTo establish a new model of rat tail intervertebral disc degeneration for observation under magnetic resonance imaging(MRI).Methods 20 SD rats were randomized into experimental group and control group,each group had 10 rats.The center of caudal C5and C6vertebrae were drilled into two cross-Kirschner wires respectively to fixed on the carbon fibrous rings,and the springs through carbon fiber rods made pressure.In control group,the same way as before,only the springs through carbon fiber rods were not pressurized.All of the rats were examined by MRI two months after the operation respectively.ResultsThe intervertebral discs were pressured smaller and vertebral bodies were bent.Control group only slight changed in T2 signal,while experimental group decreased significantly in T2 signal［(502.89±12.93)vs(334.57±27.09),t=9.712,P＜0.05］.ConclusionVertebral compression model of rat tail intervertebral disc induces the progressive degeneration of the intervertebral disc by static pressure,the cope of model provides a basis for further research on molecular mechanism of intervertebral disc degeneration and mechanical signal transduction.

Animal model;Rat;Intervertebral disc degenerative;Magnetic resonance imaging

R681.5

A

1673-7210(2015)03(a)-0029-04

2014-12-01本文編輯:衛(wèi)軻)